基于D53/SMAX1的独脚金内酯单细胞水平原位实时测定方法研究

As a newly identified category of phytohormones, strigolactones act as key regulators in the establishment and regulation of plant architecture. The dynamic localization of strigolactones in the plant and the single cell level detection method remain the least elucidated areas in the strigolactone related research fields,which become the limiting factors for the frontier research on SL signal pathway and the molecular mechanism for the regulation of plant architecture. Therefore, it is urgently needed to develop new method better than the popular method of tandem masses and capable of single cell level detection for trace strigolactones in situ and in real time. Based on the characteristics of the fast degradation of the repressor proteins of OsD53 and AtSMAX1 as mediated by ubiquitination, the DNA sequences encoding the 4 domains in the repressor will be fused with the Venus reporter gene. The SL-Degron system being highly inducible by strigolactones will be formed，screened and transformed. The SL-Degron system will serve as a built in biosensor and probe in the transformants to visualize the high resolution spatio-temporal strigolactone localization in plant tissues. By modeling such a SL-Degron system through the FACS counting of protoplasts, an accurate quantitative relationship can be established based on the multiple quantification principles of QQQ tandem mass detection for strigolactones，fluorescent intensity measurement, Q-TOF tandem mass and ELISA detection for Venus proteins. Therefore, a new method of single cell level detection of trace strigolactones in situ and in real time can be established.

独脚金内酯（SL）作为一类新的植物激素在植物株型建成中发挥重要调控作用，目前SL研究领域的薄弱环节包括植物中SL的动态时空分布以及单细胞水平的检测等，这些问题已成为SL信号途径等前沿领域的限制因子。因此，创立优于串联质谱等现有方法的植物组织和单细胞水平的SL分析技术已成当务之急。为此，本项目拟利用SL信号途径的OsD53、AtSMAX1等转录抑制蛋白可快速响应SL信号而使自身通过泛素化途径快速降解的特性，将OsD53、AtSMAX1不同结构域对应的编码DNA序列与Venus报告基因进行融合，构建融合基因表达系统，筛选获得高效响应SL信号的SL-Degron表达系统；以SL-Degron为传感器分析SL在植物组织中的精细时空分布，并通过流式细胞仪统计原生质体数目以确定单细胞中SL与Venus荧光强度、Venus蛋白含量之间的准确数量关系，建立单细胞水平独脚金内酯的原位实时分析方法。

独脚金内酯（SL）作为一类新的植物激素在植物株型建成中发挥重要调控作用，目前SL研究领域的薄弱环节包括植物中SL的动态时空分布以及单细胞水平的检测等，这些问题已成为SL信号途径及其调控机制等前沿领域的限制因子。因此，创立植物组织和单细胞水平的SL分析技术已成当务之急。为此，本项目利用SL信号途径的OsD53、AtSMAX1等转录抑制蛋白可快速响应SL信号而使自身通过泛素化途径快速降解的特性，将OsD53、AtSMAX1不同结构域对应的DNA编码序列与Venus报告基因进行融合，构建融合基因表达系统，筛选获得高效响应SL信号的SL-Degron表达系统；以SL-Degron为传感器分析SL在植物组织中的精细时空分布，并通过流式细胞仪统计原生质体数目以确定单细胞中SL与Venus荧光强度、Venus蛋白含量之间的准确数量关系，建立单细胞水平独脚金内酯的原位实时分析方法。自立项以来，项目组积极开展各项研究，取得了以下研究结果：分析和鉴定了OsD53、AtSMAX1的结构域并构建了SL-Degron载体，成功转入拟南芥获得阳性转基因株系；利用激光扫描共聚焦显微镜观察和Western Blotting分析，证明表达系统能够在转基因株系中正常工作，其荧光能原位实时反映SL在组织中的分布；通过酵母双杂交、Pull-Down等技术证明D2和M结构域能与D14互作。此外，构建了基于TiC磁性材料的独脚金内酯固相微萃取方法，并建立了基于LC-MS/MS独脚金内酯的高灵敏对照测定方法，检出限为0.01-0.03 ng/g；建立了独脚金内酯的免疫PCR（IPCR）分析方法；筛选获得新的独脚金内酯活性类似物与抑制剂，并应用独脚金内酯开展了对油菜分枝和产量的调控研究。目前已发表论文18篇，出版学术专著2部，申请国家发明专利12项，获得授权国家发明专利3项。本项目的研究成果可为独脚金内酯领域相关基础和应用研究提供重要的技术支撑，进一步提升项目组为同行提供植物激素测定服务的能力。项目总体上达到结题要求。