植物中单细胞水平微量生长素的原位实时测定方法研究

Traditional IAA assays can hardly satisfy the new demands from the frontier in phytohormonal research area for IAA determination. So it is urgent to develop new technology for IAA determination at single cell level. The following approach based on early efforts will be carried out in this project: Arabidopsis auxin biosynthesis defective double mutant yuc2yuc6 will be used as materials after being transformed by DR5::GFP, and highly sensitive in situ real time assay will be established through multiple accurate quantitative relationship of IAA with the fluorescence intensity, GFP molecule number and GFP mRNA expression level based on the expression of reporter gene GFP drived by auxin-induced promoter DR5. Secondly, highly efficient temperature-induced promoter with feasible inducing temperature will be used for the construction of controllable dual-inducing GFP expression system in model plant Physcomitrella patens to easily prepare plenty of homogeneous protoplast, then the accurate assay method of IAA in single plant cell will be achieved through the DR5 driven GFP biosynthesis and IAA induced DII-GFP degradation. Thirdly, based on the DNA terminal protection of exonuclease or nucleic acid polymerase technique, the nucleic acid probe marked by IAA will be protected through competing with IAA from samples for antibody, and the highly sensitive detection of IAA will be achieved. The detailed protocol for the above IAA detection method will be systemized and applied in the IAA determination practice, in order to promote the technology progress for phytohormone assay in our country.

传统IAA测定方法难以满足目前相关研究对生长素测定提出的新要求，建立符合目前植物激素前沿研究需求的单细胞水平微量生长素原位实时测定新方法已成为当务之急。本项目拟在前期研究工作基础上开展以下研究：进一步利用转DR5::GFP的拟南芥IAA低水平合成双突变体yuc2yuc6为研究材料，基于GFP的荧光强度、分子数量和mRNA表达量等多条途径建立IAA浓度与GFP表达量之间的准确数量关系，建立IAA高灵敏原位实时测定方法；在小立碗藓中构建双元（生长素和温度）诱导的可控GFP表达系统，通过与IAA诱导的DII-GFP降解系统进行对比，建立单细胞水平的IAA准确定量方法；基于IAA共受体和二维液相建立微量样品中IAA的高效分离纯化新技术；基于DNA末端保护小分子分析技术建立IAA的高灵敏检测新方法；系统开展所建立新方法的应用技术研究和检测应用示范，以促进我国植物激素检测的技术进步。

传统IAA测定方法难以满足目前相关研究对生长素测定提出的新要求，建立符合目前植物激素前沿研究需求的单细胞水平微量生长素原位实时测定新方法已成为当务之急。本项目通过多团队协作，集成多种前沿研究成果，深入开展了以下研究。首先，本项目构建了DRE::Gal4 AD、DR5::Gal4 BD和UAS::EGFP三个序列片段并成功导入pBI121基础载体中获得了可控诱导的EGFP表达系统。该表达系统中，DRE::Gal4 AD、DR5::Gal4 BD分别受低温、IAA的高效诱导，翻译产生的Gal4 AD和Gal4 BD结构域同时存在时才能结合成有功能的GAL4，并激活UAS::EGFP表达。经成功转化小立碗藓和拟南芥后，利用荧光定量PCR技术进行基因表达动力学分析，证实报告基因EGFP只有在低温和外施IAA同时处理下才能高效表达，因而从根本上排除了植物细胞中本底IAA对测定的干扰。以原生质体细胞为材料，在单细胞水平IAA的定量分析方法研究方面，分别获得了单细胞中IAA与EGFP mRNA、EGFP蛋白以及EGFP荧光之间的数量关系。同时还构建了DII-Venus表达系统并成功转化拟南芥和小立碗藓，且利用该系统开展了初步的单细胞水平IAA的实时原位分析研究。建立了一套二维液相在线分离IAA的硬件平台和软件方法，进一步减少了植物样品的使用量对拟南芥根系原生质体的测定取样量减少至5000个细胞。通过原核表达获得了Aux/IAA蛋白家族中的IAA1、IAA7和IAA28蛋白，并在果蝇S2细胞中表达获得了TIR1蛋白，证明了固定化的重组蛋白对IAA有较强的亲和力，可用于建立基于IAA共受体的生长素纯化方法；发展了多种核酸高灵敏信号转换与放大新原理，分别构建了基于核酸适配体发展的小分子检测新方法和基于末端保护分析发展的小分子检测方法。积极开展科研合作，先后为30余个课题组提供了测定服务，样品数超过2000个；项目共发表论文33篇（SCI收录28篇）；主编教材1部，参编专著1部，授权专利3项，申请专利1项; 培养研究生和博士后21人。