原发性胆汁性肝硬化中miRNA 29对疾病相关lncRNA AK053349的调控及在发病机制中的作用

Primary biliary cirrhosis, PBC is a autoimmune liver disease, pathogenesis being unclear. Abnormal autoantigen specific T cells play important roles in the pathogenesis of PBC, which be caused by epigenetics mechanisms. Primary studies found that expression of miRNA 29 and lncRNA AK053349 in PBC patients increased significantly, relating to the course; inhibition of miRNA 29 leaded to reducing expression of lncRNA AK053349。Therefore this project would investigate mechanisms of regulation of miRNA 29 on lncRNA AK053349 in the pathogenesis of PBC, by methods of chromatin immunoprecipitation, cloning and RNA interfering, et al, providing clues to rebuilding autoimmune tolerance and treatment of PBC.

原发性胆汁性肝硬化（Primary biliary cirrhosis, PBC）是一种自身免疫性肝病, 治疗比较棘手，发病机制尚不明确。研究表明，自身抗原特异性T细胞功能异常是PBC发病机制的关键因素，表观遗传学调节机制异常是导致T细胞对自身免疫耐受缺失的重要原因之一。我们的前期研究发现，PBC患者自身抗原特异性T细胞中miRNA 29和lncRNA AK053349表达显著增高，且与病程相关联；抑制miRNA 29可引起lncRNA AK053349表达显著下降。因此，本课题拟利用染色质免疫沉淀、基因克隆、RNA干扰等手段在PBC 自身抗原特异性T细胞以及PBC小鼠模型中研究疾病相关miRNA 29对lncRNA AK053349的调控及在发病机制中的作用，为探讨免疫干预重建自身免疫耐受的新途径提供依据，将为自身免疫病治疗提供新理念。

结题按计划完成。已发表专业论文42篇，其中SCI论文24篇，研究主要结果如下：.（1）.PBS自身抗原特异性T细胞中差异表达miRNA和IncRNA的筛选.通过表达谱芯片筛选并证实与PBC病情相关的lncRNA AK053349和miRNA 29；AK053349被抑制的自身抗原特异性T细胞，经PDC-E2刺激12h IFN-γ、IL-12、TNF-α的浓度下降，12h后细胞增殖能力较对照组显著降低(P<0.01)；过表达AK053349则IFN-γ、IL-12、TNF-α浓度显著增高。miR-29被抑制的自身抗原特异性T细胞在刺激后12h、24h特异性增殖能力均较其它三组显著降低（P<0.01），而IL-12、TNF-α浓度的改变未见显著差异。 .（2）.miRNA和IncRNA AK053349功能的验证.通过对表达谱芯片进行生物信息学分析，发现DNMT3B可能是miR-29的靶基因。分别将质粒与miR-29 mimics或negative control RNA共转染至自身抗原特异性T细胞中，发现相较于共转染negative control RNA组，共转染miR 29 mimics组的萤光素酶活性显著下降。IL-21可促进PDC-E2反应性Th17分化，抑制PDC-E2反应性Treg分化。.（3）.miRNA和IncRNA AK053349作用的调控机制研究.证实miR-29通过DNMT3B调节IncRNA AK053349的表达。构建GATA-6过表达载体p-EGFP和抑制载体siGAT A-6，分别转染至自身反应性T细胞，经PDC-E2刺激24小时后发现，GATA-6过表达组中，miR-29表达增高约6倍，DNMT3B表达下降0.5 倍，AK053349表达增高约3.7倍；上清液中IFN-γ和IL-12的水平明显增高。.（4）.在PBC小鼠模型研究miRNA调控IncRNA AK053349的作用对自身免疫样病变的影响.构建PBC小鼠模型，结果表明干扰lncRNA AK053349可以抑制polyI:C诱导的PBC小鼠血清AMA抗体的产生，干扰lncRNA AK053349可以抑制polyI:C诱导的小鼠肝脏PBC样病变。miR29可以负向调控DNMT3B表达，正向调控AK053349表达，抑制miR29可以减轻小鼠肝脏PBC样病变，影响疾病发展。