食用真菌组合表达白藜芦醇的研究

Resveratrol is a polyphenolic stilbenoid that possesses many very important medicinal and healthy effects. And its contents in natural plants are very low or trace amount. Based on the scientific understandings that edible fungi possess the similar stilbene biosynthetic pathways or metabolic compensation pathways to resveratrol, this project will develop metabolic engineered strains of edible fungi to combinatorially express resveratrol by using systems biology theory, metabolic engineering and synthetic biology engineering technology. The combinatorial expression vectors with multiple single-gene expression cassette and the combinatorial expression vectors with multi-gene expression cassette will be constructed by using enzymatic assembly technology and the resveratrol biosynthetic genes cloned from grape and peanut. Flammulina velutipes, Pleurotus ostreatus, Lentinula edodes, Tremella fuciformis will be co-transformed with multiple vectors to produce transformants with multi-genes and combinatorial expression of resveratrol. The combinatorial expression conditions will be optimized to investigate the multi-gene combinatorial expression profiles. And the genetic mechanism of resveratrol biosynthetic genes in multi-gene transformants of edible fungi will be elucidated. This research will lay the solid scientific foundation and provide technology support for the combinatorial expression of resveratrol with metabolic engineered edible fungi as bio-reactors. This will be of great scientific significance and huge practical application value to alleviate the contradiction of supply and demand of resveratrol, to elucidate the biosynthetic and metabolic mechanisms of polyphenolic stilbenoid and steroid and flavonoid of edible fungi.

白藜芦醇是一种具有重要医疗和保健作用的多酚芪类化合物，在生物体内含量极低。本项目基于食用真菌具有与白藜芦醇同系的多酚芪类化合物生物合成途径或代谢补偿途径的科学认识，应用系统生物学理论和代谢工程与合成生物学工程技术，拟利用本项目组已从葡萄、花生中克隆的白藜芦醇生物合成与代谢途径基因，采用酶法组装新技术，构建白藜芦醇生物合成基因的"多个单基因表达盒的组合表达载体"和"多基因表达盒的组合表达载体"，多载体共转化食用真菌金针菇、平菇、香菇、银耳，筛选组合表达白藜芦醇的食用菌多基因转化子，优化转化子的组合表达条件，揭示多基因组合表达模式，阐明白藜芦醇基因在食用菌多基因转化子中的遗传规律。本研究为利用食用菌作为生物反应器组合表达白藜芦醇奠定科学基础、提供技术支撑，对缓解白藜芦醇供求矛盾、揭示食用菌多酚芪类化合物和甾醇类及黄酮类化合物的生物合成与代谢机理具有重大科学理论意义和实际应用价值。

白藜芦醇是一种具有抗癌、抗炎症等多种医疗保健功能的植物抗毒素。然而，白藜芦醇在植物体内含量低且用传统提取方法成本高，因此采用基因工程手段异源表达获取白藜芦醇是研究的热点。根据已阐明的生物合成途径，本项目从花生、葡萄、大豆、拟南芥、虎杖和何首乌中克隆得到了白藜芦醇合成途径中6个关键酶基因，采用食用真菌灰盖鬼伞、杏鲍菇、金针菇、银耳以及大豆、大肠杆菌和酿酒酵母等宿主对克隆的基因进行了组合表达，获得了以下重要的研究成果：.（1）白藜芦醇合成途径中关键酶基因在灰盖鬼伞中的表达。首次以灰盖鬼伞为表达宿主，引入白藜芦醇合成酶基因（rs）和辅酶A连接酶基因（4cl），转化子成功合成白藜芦醇。.（2）白藜芦醇合成途径中关键酶基因在杏鲍菇中的表达。首次以杏鲍菇为表达宿主，引入rs基因。.（3）白藜芦醇合成途径中关键酶基因在金针菇中的表达。首次以金针菇为表达宿主，引入rs基因和4cl基因，转化子成功合成白藜芦醇。.（4）白藜芦醇合成途径中关键酶基因在银耳中的表达。首次以银耳为表达宿主，引入rs基因和4cl基因，转化子成功合成白藜芦醇。.（5）白藜芦醇合成途径中关键酶基因在大豆中的表达。首次以大豆为表达宿主，引入rs基因进行诱导培养生成白藜芦醇，且整合基因能够稳定遗传。.（6）白藜芦醇合成途径中关键酶基因在酿酒酵母的组合表达。以酿酒酵母为表达宿主，整合rs基因和4cl基因，其白藜芦醇产量为对照组的2倍，将此菌株可运用于葡萄酒酿造。.（7）白藜芦醇合成途径中关键酶基因在大肠杆菌中的组合表达。以大肠杆菌为表达宿主，引入rs基因和4cl基因进行诱导培养，并利用生物信息学技术和CRISPRi系统，设计出含有rs，4cl和tal多酶组合反应体系的整合型大肠杆菌工程菌，其产反式白藜芦醇达到204.36±3.18 mg/L。