食用真菌组合表达紫杉醇及其中间产物的基础研究

本项目基于食用菌与目前人类发现的能够生物合成紫杉醇的真菌都是丝状真菌、具有紫杉醇等萜类化合物生物合成途径或代谢补偿途径的认识，应用系统生物学理论和合成生物学工程与代谢工程技术，计划利用本项目组已经克隆的南方红豆杉和曼地亚红豆杉中紫杉醇生物合成途径的所有二十个基因，采用酶法组装新技术，构建紫杉醇生物合成基因的"多个单基因表达盒的组合表达载体"和"多基因表达盒的组合表达载体"，多载体共转化食用菌金针菇、银耳、灵芝、猴头菇、蛹虫草，筛选组合表达紫杉醇或其中间产物的食用菌多基因转化子，优化紫杉醇或其中间产物在食用菌多基因转化子中的组合表达条件、揭示多基因组合表达规律，研究阐明紫杉醇生物合成基因在食用菌多基因转化子中的遗传规律。为利用食用菌组合表达抗癌特效药紫杉醇或其中间产物奠定科学基础、提供技术支撑。对缓解紫杉醇药源紧缺和供需矛盾、揭示食用菌萜类化合物生物合成机理具有重大意义和价值。

紫杉醇（Taxol)是从红豆杉树皮中提取出来的一种具有独特抗肿瘤作用的二萜类天然产物，含量极低，其代谢途径中目前已知的关键酶基因有13个。本项目从曼地亚红豆杉、东北红豆杉、南方红豆杉中克隆得到了紫杉醇合成途径中的12个关键酶基因，采用金针菇、灰盖鬼伞、灵芝、银耳、猴头菇等对克隆的基因进行了表达，同时采用大肠杆菌为宿主表达了DBAT基因并尝试构建无细胞催化体系，获得了以下重要研究结果：.（1）紫杉醇合成途径中关键酶基因在灰盖鬼伞中的表达。首次以灰盖鬼伞为表达宿主，引入紫杉醇合成途径中关键酶基因GGPP合酶基因（ggpps）和紫杉烯合酶基因（ts），研究结果表明引入单基因ggpps灰盖鬼伞工程菌株能够表达出目标产物GGPPS,而引入单基因ts没有检测到目标产物。同时引入ggpps和ts的组合表达载体获得的双基因工程菌株，检测结果表明了灰盖鬼伞成功组合表达了目标产物紫杉烯。把紫杉醇合成途径中的第13号关键酶基因10-去乙酰巴卡亭Ш乙酰转移酶基因(DBAT)引入灰盖鬼伞中，结果表明灰盖鬼伞能正确表达该酶。.（2）紫杉醇合成途径中关键酶基因在金针菇中的表达。首次以金针菇为宿主菌引入10-去乙酰巴卡亭Ш乙酰转移酶（DBAT）基因进行表达，获得了金针菇工程菌株，经检测结果表明金针菇菌丝里表达了目标产物。同时，采用同样的方法把紫杉烯合酶基因ts转化进金针菇获得了转基因菌株。.（3）紫杉烯合酶基因ts在灵芝和猴头菇中的表达。首次以美国灵芝和猴头菇为表达宿主，引入紫杉烯合酶基因ts，获得了转基因灵芝和猴头菇菌株，结果表明了转基因灵芝检测到了表达产物。.（4）紫杉醇代谢途径中相关多基因表达载体的构建。采用一步等温法及改良法创造性地构建了2个基因、3个基因和4个基因的组合表达载体。.（5）紫杉醇合成途径中关键酶基因在银耳芽孢中的组合表达。以银耳芽孢为受体细胞，利用组合表达载体在银耳芽孢中表达紫杉醇合成途径中关键酶基因，结果表明银耳芽孢成功表达了单基因ggpps的产物GGPPS、双基因ggpps和ts基因串联组合表达出紫衫二烯，三个基因ggpps、ts和T5aOH基因组合表达出紫杉二烯-5α-醇（紫杉醇的中间产物）。.（6）尝试构建紫杉醇代谢途径中关键酶的无细胞催化体系。采用原核表达宿主表达DBAT基因，获得纯酶，研究了酶的性质并在体外进行催化实验。