黄芩中黄芩苷次生代谢关键酶基因表达的分子生态机制研究

Scutellaria baicalensis Georgi (Huang-qin or Chinese skullcap) is a very important medicinal plant in China. The baicalin is the major medicinal effective ingredient. The genes encoding the key enzymes in the baicalin biosynthetic pathway are not clear, especially the genes in the downstream pathway (noly UBGAT). Few researches about the relativity between gene expression and ecological factors had been done, as well as the study of physiological and ecological regulation mechanism of baicalin biosynthesis, which restricted innovation and development of medicinal quality control technique. So, the genes （CHI、FNS、F6H、UBGAT and GUS）were first selected to cloned in our study. The wild S. baicalensis seeds reproductive population was taken as the materials. The primers were designed according to the conserved region based on the baicalin biosynthetic pathway and GenBank database. Based on these, the effects of different factors (such as light, temperature, water and nutrient elements) to gene expression were investigated through the root lines culture (a relatively stable and controllable system) and pot experiments (a relatively complex and controllable system). Meanwhile, the ecological relationship of the important endogenous signal molecule, NO, JA and SA, and objective gene expression level was studied. The intensive study of physiological and ecological regulation mechanism of baicalin biosynthesis provided the basic data for realizing stable and controllable medicinal quality.

药材质量的“安全、有效、稳定、可控”是中药材生产的重要目标。黄芩的主要药效成分黄芩苷是其药材质量的重要标志。有关次生代谢途径关键酶基因表达的分子生态机制研究，是阐明其药材质量形成规律、创新药材质量调控技术、实现药材质量稳定可控目标的重要基础。本项目拟以野生黄芩种子扩繁群体为材料，以黄芩苷生物合成的次生代谢途径为基础，根据NCBI数据库中已报道的相关酶基因的保守区设计引物，开展黄芩苷生物合成中下游酶（CHI、FNS、F6H、UBGAT和GUS）基因表达的分子生态机制研究。以此为基础，在毛状根培养（相对稳定可控体系）和盆栽试验（相对复杂可控体系）条件下，开展光照、温度、水分及营养元素等生态因子调控对黄芩苷次生代谢关键酶基因表达的影响，以及NO、JA和SA等内源信号分子与黄芩苷代谢关键酶基因表达的生态关系研究，阐明黄芩苷的生物合成、转化与积累的分子生态机制，为黄芩药材质量调控技术的创新奠定基础。

黄芩作为传统大宗中药材，市场需求量大，但是存在药效成分不稳定、含量差异大的问题。因此，清晰的认识黄芩药效成分的次生代谢过程及其合成积累的分子生态机制，是实现药材质量控制的重要基础。本项目以黄芩苷生物合成的次生代谢途径为基础，把黄芩苷合成途径关键酶基因研究（单基因水平）与转录组分析（基因调控网络）研究相结合，在黄芩愈伤组织、毛状根（相对稳定可控体系）和盆栽试验（相对复杂可控体系）条件下，开展了温度、水分及诱导子等生态因子对黄芩苷次生代谢的调控研究。项目完成了对黄芩愈伤组织和发根的诱导并建立了稳定的培养继代体系，为后续生态调控研究奠定了基础。对黄芩愈伤组织和发根生态调控研究发现，温度和水分通过调节黄芩SOD、POD等抗氧化酶活性和黄芩苷合成途径关键酶基因PAL、CHS、FNS的表达促进黄芩苷的积累。适量外源添加水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）可同样达到促进黄芩苷积累的效果，且在此条件下黄芩关键酶活性和次生代谢关键酶基因的表达均处于较高水平，进一步说明SA和MeJA等参与了水热调控下黄芩苷的生物合成过程。与此同时，本项目以盆栽黄芩为研究对象，系统开展了不同干旱胁迫方式对黄芩苷次生代谢及其分子生态调控机制的研究。结果发现，干旱胁迫有助于黄芩苷的积累，并且这种响应规律具有短时性，黄芩的抗氧化酶系统和渗透调节系统均参与了此过程，生殖生长期可作为黄芩水分调控的最佳时期。转录组研究发现，有大量差异表达基因被富集到碳代谢、植物激素转导、苯丙烷代谢、苯丙烷生物合成等代谢通路，包括活性氧清除基因和渗透调节物质合成基因，这与室内调控研究结果相互验证。此外，本项目还挖掘出MYB和WRKY转录因子家族中的2个转录因子对干旱胁迫下黄芩苷生物合成具有重要的调控作用。本项目的研究结果为提升黄芩的精细化栽培技术提供了重要的科学依据。