黄芩苷增强环丙沙星抗菌活性的分子机制

Our previous study has shown that baicalin can significantly increase the antibacterial activity of ciprofloxacin and decrease the mRNA expression of active efflux gene acrB in fluoroquinolones resistant Escherichia coli strains. But whether baicalin will affect other efflux pump genes and its regulator genes remains unclear. In this study, baicalin will be assumed to be ciprofloxacin efflux inhibitor and the following research will be performed. (1) Under the appropriate concentration of baicalin, the efflux pump genes and regulatory genes (namely “target genes”) will be screened by determining the mRNA expression levels of active efflux related genes in the resistant strains using qRT-PCR. (2) The deletion, silence and over expression of target genes will be performed via Red homologous recombination, the antisense oligonucleotide interference and induction, respectively. The influence of baicalin to target genes were clarified by determining the strains sensitivities, the amount of target genes mRNA expression, ciprofloxacin concentrations in the strains. This study can confirm active efflux related target genes in the process of increasing antibacterial activity of baicalin to ciprofloxacin. Therefore it can provide the important theoretical basis for the anti-infection treatment and the development and utilization of fluoroquinolones.

前期发现，黄芩苷能增强环丙沙星对耐氟喹诺酮类大肠埃希菌的抗菌活性，减少其主动外排基因acrB 的mRNA表达量，但是否会影响其它外排泵基因及调控基因表达，目前还不清楚。本课题拟假设黄芩苷为细菌外排环丙沙星的抑制剂，进行如下研究：（1）在适宜黄芩苷浓度下，通过qRT-PCR测定耐药菌株中主动外排相关基因mRNA表达量的变化，筛选、挖掘受黄芩苷影响的主要外排泵基因及其调控基因（即“靶基因”）；（2）通过Red同源重组、反义寡核苷酸干扰、诱导等手段，分别对靶基因进行缺失、沉默及过表达，并从不同菌株的敏感性、靶基因mRNA表达量、环丙沙星集聚浓度等明确黄芩苷对靶基因的影响。该项目通过对黄芩苷增强环丙沙星抗菌活性的主动外排相关靶基因的研究，为抗耐药菌感染治疗、氟喹诺酮类药物的开发利用提供重要的理论依据。

为研究黄芩苷增敏喹诺酮类药物环丙沙星主动外排相关机制，从295株动物源菌株中，筛选环丙沙星最小抑菌浓度（MIC）大于64μg/mL的菌株，测定黄芩苷对环丙沙星联合分级抑菌浓度（FIC）为0.375，证实二者为协同效应；1/16、1/8 MIC黄芩苷显著降低环丙沙星的MIC，高的黄芩苷浓度不能降低环丙沙星MIC，反而会使其MIC值增加；将黄芩苷和环丙沙星共同培养菌株，比较其与两药单独培养菌株、CCCP和环丙沙星共同培养菌株外排表达量差异，结果发现，加入黄芩苷与环丙沙星共同培养菌株和单独加环丙沙星相比，acrA、acrB、acrD、mdtA、marA、robA、soxS表达量显著降低，尤其是acrA、acrD、marA，提示三者是黄芩苷提高环丙沙星的关键靶点；acrB、mdtA、robA、soxS基因可能也是黄芩苷的靶点，但作用相对较弱。acrE、acrF不是黄芩苷的靶点。经过1/2MIC 环丙沙星诱导，所有菌株对环丙沙星耐药强度都发生了不同程度改变，在起始阶段，先表现小幅下降或者缓慢升高，达到峰值以后，表达量却又趋于下降。设计acrA、marA、acrD3个基因反义寡核苷酸引物，设置空白对照组、黄芩苷组、反义寡核苷酸沉默组、反义寡核苷酸沉默+黄芩苷组进行实验，发现相对于空白对照，黄芩苷组菌落数显著降低；acrA、acrD、marA基因沉默组与空白对照组及黄芩苷组相比，多数菌株菌落数出现不同程度下降，具有显著性差异；acrA、marA基因沉默+黄芩苷组与单独的基因沉默组相比，多数菌株变化差异不显著；acrD基因沉默+黄芩苷组与acrD基因沉默组相比，多数差异显著。提示黄芩苷主要通过抑制acrA、marA发挥外排抑制作用，acrD不是其增强环丙沙星敏感性主要靶点。通过Red同源重组，在标准菌株K12中缺失主动外排基因acrA、marA，利用噬菌体转导技术，构建以上8株耐药菌株的acrA、marA基因缺失株，并在耐药菌中构建二者双基因缺失株。本研究找出了黄芩苷增敏环丙沙星的关键靶基因acrA、marA，为抗耐药菌感染治疗、氟喹诺酮类药物和中药成分的配合应用提供理论依据。