小胶质细胞P2X4受体互作蛋白的鉴定及功能研究

P2X4 receptor expression and function in microglia cells is critical for the development of neuropathic pain. However, since P2X4 receptors are widely expressed in neurons, drugs targeting P2X4 receptors in microglia cells would cause side effects by binding the receptors in neuron. In the project, we will identify the proteins which interact with P2X4 receptors and modulate their function in microglia cells, making them druggable targets for specifically modulating P2X4 receptors in microglia cells. Our preliminary studies have indicated that P2X4 receptors are more active in microglia cells, thus we will first utilize P2X4-pHluorin123 receptors to study if EC50 and open probability of P2X4 receptors are different in neurons and microglia cells. Then proteins interacting with P2X4 receptors in neurons and microglia cells will be immunoprecipitated and compared by 2-D PAGE. Proteins interacting with P2X4 receptors in microglia cells will be identified by mass spectrometry. At last, we will study how these identified proteins modulate the function of P2X4 receptors.

小胶质细胞中P2X4受体的表达对神经源性疼痛的发生发展发挥重要作用，但由于P2X4受体在神经元中的广泛表达，使得针对小胶质细胞P2X4受体的开发遭遇困境。此课题试图寻找在神经元和小胶质细胞中差异表达的P2X4受体互作蛋白，探索他们对P2X4受体功能的影响。我们的前期研究已经发现P2X4受体在小胶质细胞中具有更高的活性，所以此课题将首先利用能够量化细胞膜P2X4受体表达的P2X4-pHluorin123受体研究P2X4受体在神经细胞和小胶质细胞中EC50和开放概率的差异。然后我们免疫沉淀在神经细胞和小胶质细胞中和P2X4受体相互作用的蛋白并通过二维PAGE胶比较他们的差异。在小胶质细胞中和P2X4受体相互作用的蛋白将通过质谱技术得以签定。在确认这些蛋白的身份后，我们进一步研究这些互作蛋白如何影响P2X4受体的功能。

小胶质细胞中P2X4受体的表达对神经源性疼痛的发生发展发挥重要作用，但由于P2X4受体在神经元中的广泛表达，使得针对小胶质细胞P2X4受体的开发遭遇困境。此课题试图寻找在神经元和小胶质细胞中差异表达的P2X4受体互作蛋白，探索他们对P2X4受体功能的影响。我们首先在HEK细胞建立了免疫沉淀分离P2X4受体复合物的方法。我们通过western blot确认了P2X4抗体可以结合P2X4蛋白形成复合物结合到Protein A磁珠上，并且竞争性肽段可以将50%的P2X4受体复合物从受体抗体结合复合物中脱离。在C8-B4细胞上，我们采用同样的方法分离了P2X4受体复合物，通过质谱分析肽段和SDS-PAGE分离磁珠结合的蛋白，我们认为P2X4受体复合物在C8-B4细胞中仍然是一个同源三聚体，没有其他相互作用的蛋白。P2X4受体在小胶质细胞的功能亢进可能是由于P2X4受体的转录后修饰，需要进一步的研究阐述其机制。P2X4受体的开放主要调节小胶质细胞内的钙浓度，另外一个重要的调节钙离子浓度的通路就是钙池操控钙内流，所以在此项目中，我们也对小胶质细胞C8-B4的钙池操控钙内流进行了研究，阐述了钙池操控钙内流在小胶质细胞的功能。