基于光控分子开关酶法制备安全高效低分子量肝素的新策略

Hemorrhage and heparin-induced thrombocytopenia are the well-known adverse effects of heparin, which limits its present clinical use. Low molecular weight heparin (LWMH) prepared through the controlled chemical or enzymatic depolymerization of heparin has gradually replaced heparin for clinical applications due to its similar anticoagulant activity with lower incidences of side effects. Heparinase III (HepIII) can selectively depolymerize heparin at undersulfated domains without destroying the antithrombin III (AT-III) binding site and is most likely to be an effective tool for the preparation of novel LMWH. In our previous study, we obtained a HepIII double mutant (K130C&D453A) by protein engineering of HepIII. This mutant can cleave heparin at new glycosidic linkages to generate better LWMH with a narrow size distribution and favorable anticoagulant activity. Given that azobenzene photoswitches can be conveniently linked to proteins by selective conjugation to the thiol group of cysteine residues to control biomolecular function with phtoswitch, in the present study, we will couple azobenzene derivative with K130C&D453A to trigger the light-controlled reversible regulation of the enzymatic activity and catalytic process of HepIII mutant, elucidate the novel cleavage pattern and mechanism of HepIII mutant for the depolymerization of heparin, and finally establish a simple, efficient and precisely controllable process for the production of novel LMWH. Meanwhile, this study may also lay a foundation for the development and application of novel heparinases in the depolymerization of other members of glycosaminoglycans family.

出血风险高、血小板减少等副作用是制约肝素临床使用的关键，将其裂解成低分子量肝素（LMWH）已成为提高安全性的有效途径。肝素酶III（HepIII）能选择性地裂解肝素链的非磺酸化结构域且不破坏抗凝血酶III（AT-III）结合位点，成为制备新型LMWH的有效工具。本课题组前期通过分子改造获得了裂解方式发生改变的HepIII双突变体（K130C&D453A），产物的分子量分布相对集中且安全性显著提高。鉴于Lys130位点对HepIII构象转变的重要性，本课题拟将偶氮苯衍生物作为光控分子开关偶联至HepIII双突变体的K130C位点，通过人工光学方式双向可逆地调控HepIII双突变体，实现肝素裂解过程可控、酶能循环利用和产物可快速分离。在阐明裂解肝素新机制的基础上，建立光敏可控制备分子量相对均一、安全性显著提高的新型LMWH的策略和方法，为研究新型肝素酶或多糖裂解酶及其应用提供参考和借鉴。

鉴于糖类物质的复杂性和多样性，其定向裂解和生物合成都非常困难。本项目针对以低分子量肝素为代表的多糖以及稀有糖，利用酶的选择性和特殊性开展一系列创新性研究。采用HepIII突变体K130C和偶氮苯光敏分子开关构建了新型光控酶，根据其在不同波长下的结构转换实现了酶活的开关调控。通过优化反应体系、循环利用光控酶以及温度诱导的产物沉淀以实现快速分离等研究，采用该酶安全高效地裂解肝素而得到了高质量低分子量肝素。在此基础上，通过对低分子量肝素进行部分脱硫，实现了抗凝与抗炎活性的分离，进一步采用三种肝素酶组合裂解等方式，获得了结构差异显著的不同组分。在抗炎活性指导下，建立了低分子量肝素抗炎作用的构效关系并阐明了发挥抗炎作用的结构基础。从构效关系出发，设计并合成了具有良好抗炎活性的寡糖，具有开发成为新型抗炎药物的潜力。. 基于糖的结构改造对其功能带来显著影响，因此研究内容进行了进一步的拓展。通过构建CPM-2大肠杆菌工程菌株，用于UDPG的再生，将糖基转移酶OleD与工程化大肠杆菌偶联，在不添加UDPG的情况下，经全细胞催化甜茶苷完全转化为莱鲍迪苷KA。通过证明糖基转移酶-UDPG再生系统可以完全革除UDPG的外源性添加，能够广泛应用于选择性生物合成各种功能性糖苷。同时，肝素是由糖醛酸和D-氨基葡萄糖以1-4糖苷键连接的二糖重复单元组成的线性多糖，而细胞色素P450酶在糖肽类抗生素生物合成过程中能催化连接肽链中的关键芳香基团。对P450酶体外催化体系开展了系统研究，证明了维生素B2直接参与P450酶的氧化催化，提出一种全新的电子转移途径。根据开发的新的糖基化手段，获得了更多的生物催化元件和反应体系用以糖类化合物的结构改造和修饰。在此基础上利用微生物及酶催化合成L-古洛糖，建立了从葡萄糖制备L-古洛糖的组合生物合成途径，为绿色高效制备稀有糖建立了新的方法。. 本项目的完成不但解决了肝素的光控裂解以提高低分子量肝素的质量问题，而且揭示了新的催化机制和构效关系以及建立了多个活性糖生物合成的新方法，为拓宽活性糖类的应用奠定了良好的基础。