采用前体肽基因置换策略定向生物合成新颖诺卡沙星衍生物

诺卡沙星是一种具有超强抗多重耐药菌活性的硫肽类抗生素，但通过侧链结构修饰增加其成药性的努力没有获得成功。近期阐明的生物合成途径是核糖体翻译后修饰机制，这为通过遗传操作改变其生物合成基因簇获得母核结构多样、成药性显著提高的诺卡沙星衍生物奠定了基础。基于本课题组对诺卡沙星及其生物合成途径的研究积累，本研究拟采用基因工程和组合生物合成等技术与手段，在完善拟无枝菌酸菌遗传操作体系的基础上，对诺卡沙星前体肽（包括前导肽和结构肽）进行染色体基因置换定向生物合成母核结构多样的诺卡沙星衍生物库，通过分离纯化、结构鉴定和活性筛选，最终获得成药性大的诺卡沙星衍生物。本研究将通过基因组遗传操作定向组合生物合成微生物次生代谢产物以丰富天然活性物质的来源，为定向改造各种硫肽类抗生素提供技术支撑。此外，前导肽的相关研究还有望阐明其在核糖体翻译后修饰过程中的功能，为揭示硫肽类抗生素翻译后修饰的调控机制奠定理论基础。

诺卡沙星是由拟无枝酸菌（Amycolaptosis fastidiosa ATCC202099）产生的一种新型硫肽类抗生素。由于该菌存在很强的限制修饰系统，相较于链霉菌的遗传操作系统而言，该属的基因操作技术远远落后，缺少有效地遗传工具和方法。本项目首先探索了以pKC1139温敏型质粒为出发质粒，通过供体菌E.coli ET12567/pUZ8002与受体菌A. fastidiosa ATCC202099进行接合转移。建立了适用于该菌染色体基因置换的遗传操作体系，但接合转移后基因交换效率较低，不适用于批量操作。通过文献检索和序列比对，我们发现诺卡沙星和另一种同系列的硫肽抗生素诺西肽在结构上高度相似，二者的合成途径基本相同，尤其是决定它们最终结构的核心肽序列仅有一个氨基酸之差。但诺西肽产生菌S. actuosus ATCC25421为链霉菌，该菌遗传操作体系相对比较成熟，接合转移后交换效率高，易于批量操作，因此，综合各方面因素本项目将研究对象更改为诺西肽。虽然研究对象改变，但研究目标和内容与原计划均保持一致。通过诺西肽生物合成途径的理性置换和改造，初步解析了诺西肽生物合成途径，推测了前导肽在硫肽类抗生素翻译后修饰过程中的功能，并定向生物合成了16个结构多样的新型诺西肽衍生物，进而获得了4个成药性较高的新颖活性化合物。针对这些衍生物的产量都特别低，难以分离提取的特点，本项目额外增加了对诺西肽生物合成的转录调控机制方面的研究工作，以期通过调控生物合成途径改善新型活性代谢产物的产量。该研究不仅为诺西肽产生菌及新型活性代谢产物产量的提高创造了可能，也为深入理解翻译后修饰天然产物的代谢调控途径和机制提供了新方法和新思路。本研究相关成果共发表SCI论文6篇，累计影响因子19.725，申请中国发明专利3项，获授权1项。通过本项目研究，培养2名博士研究生和4名硕士研究生，其中硕士生马敏的学位论文入选“2015年度江苏省优秀硕士学位论文”。