转录因子QM的磷酸化过程与炎癌转化关系的研究

The malignant transformation of unresolved inflammation is closely related to the expression and regulation of transcription factors, and transcription factors are usually involved in multiple steps of the malignant transformation. Parthenolide is a sesquiterpene lactone extracted from medical plants, which exhibits both anti-inflammatory and antitumor activities, depending on a wide range of intracellular signaling networks. Previous finding in our laboratory indicated that the phosphorylated QM is a target of parthenolide in tumor cells by proteomics analysis. Given that parthenolide can effectively inhibit NF-κ B in tumor cells, NF-κ B can promote the activity of JNK, and JNK is able to phosphorylate QM, we hypothesize that the pathway of NF-κ B -JNK-QM phosphorylation -inflammatory cytokine release-tumorigenesis may represent a new avenue in the malignant transformation from unresolved inflammation. Taken the phosphorylation of QM as a major step, the present project will conduct following studies to investigate the above hypothesis: a) NF-κ B activates JNK to phosphorylate QM; b) phosphorylated QM regulates the expression of cytokines, such as IL-1, IL-6, COX2, VEGF; and c) QM mediated cytokine releases result in the malignant transformation of unresolved inflammation in mice. This project will provide a key factor in the malignant transformation process from unresolved inflammation, which could be shared by multiple regulatory networks. Meanwhile, this project will also lead to better understanding of complex networking and regulation in the process of malignant transformation from unresolved inflammation.

非可控性炎症的恶性转化过程与转录因子的调控密切相关，现有证据表明转录因子参与了这一转化过程中的多个环节。本课题组通过蛋白组垂钓技术在肿瘤细胞中发现具有显著抗炎和抗肿瘤活性的小白菊内酯与转录因子QM的磷酸化形式具有高度亲和力。基于NF-κB是小白菊内酯发挥抗炎作用的直接靶标，NF-κB可提高蛋白激酶JNK活性，并且QM可被JNK磷酸化，我们推测在非可控性炎症恶性转化过程中存在NF-κB—JNK—QM磷酸化—炎症因子—肿瘤细胞发生间的新途径，从而导致癌症。本课题将以QM的磷酸化过程为切入点，阐述NF-κB激活JNK磷酸化QM，磷酸化后的QM介导IL-1、IL-6、COX2、VEGF等相关基因和炎症细胞因子异常表达调控的分子机制。本课题研究有望确定非可控性炎症恶性转化过程中多条网络调控通路共享的新型关键分子，增加对复杂网络调控系统的认知，为最终揭示非可控性炎症恶性转化的分子机制作出贡献。

非可控性炎症的恶性转化过程与转录因子的调控密切相关，现有证据表明转录因子参与了这一转化过程中的多个环节。本课题组前期通过蛋白组垂钓技术在肿瘤细胞中发现具有显著抗炎和抗肿瘤活性的小白菊内酯与转录因子QM 的磷酸化形式具有高度亲和力。为了验证磷酸化QM是非可控性炎症的恶性转化过程中的重要节点，本课题组从QM磷酸化过程的发现、磷酸化QM抗体制备、基于CRISPR-Cas9系统的人肝癌细胞QM基因定向编辑、细胞表型测定、ChIP-Seq和转录组分析以及信号通路研究等方面开展了工作，发现仅HepG-2中获得的QM在104位丝氨酸上发生磷酸化，QM磷酸化过程是肿瘤细胞中独有的现象。同时，制备了磷酸化QM抗体，抗体效价超过 1:80000，磷酸化多肽与非磷酸化多肽效价区分大于16，成为开展研究的有效工具。另一方面，通过CRISPR-Cas9系统基因编辑，获得了一株 QM敲除的HepG-2细胞株，经细胞增殖、侵袭、凋亡和克隆形成等实验发现QM仅抑制肿瘤细胞克隆的形成。ChIP-Seq数据显示QM作为转录因子主要作用于基因间区，处于内含子和基因上游20k之内的区域。qm在染色体上一共能识别六种motif。通过GO功能分析，peak相关基因与细胞增殖、生长、发育和信号转导等功能相关。结合motif结构和功能预测，获得了7种肿瘤相关基因，分别为TTC34、GUSBP1、NBPF10、STIM1、CDH12、PTPRN2和CTNND2。它们可能与QM相互结合，对下游基因进行转录调控。结合转录组分析数据，初步确认QM调控的基因是PTPRN2、STIM1和CTNND2。采用荧光素酶报告系统发现，QM对PTPRN2和STIM1启动子区域为抑制作用，对CTNND2是上调。随后，进一步发现磷酸化QM在NF-kB通路中与p50、p65、IKBα不存在相互作用，但与STAT3发生相互作用。因此，初步确定在HepG-2细胞质中STAT3调控了QM磷酸化，进入细胞核后QM作为转录因子，调控TTC34、STIM1和CTNND2等基因的表达，从而发挥抑制肿瘤细胞克隆形成的作用。本课题已公开中国专利二项，投稿SCI论文两篇。本研究初步阐明了QM 的磷酸化如何介导相关基因和炎症细胞因子的异常表达以及导致非可控性炎症的恶性转化，为进一步绘制以QM 为关键节点的非可控性炎症恶性转化过程的信号网络系统提供依据并奠定基础。