DNA复制起始蛋白Mcm6-Cdt1相互作用的结构与功能研究

DNA复制起始受复制前复合物(pre-RC)的严格控制。微小染色体维持蛋白 (MCM) 复合物是pre-RC的重要组分，由 Mcm2-Mcm7六个亚单位组成，被认为是DNA复制过程中的解链酶并在复制叉的延伸过程中发挥关键作用。在细胞周期的M晚期和G1早期，Mcm2-7复合物依赖于pre-RC的另一个重要亚单位Cdt1而结合于染色质,但其作用方式仍然未知。目前，已确认的Cdt1与Mcm2-7亚单位的相互作用限于Mcm6-Cdt1。申请人发现Mcm6羧基末端能够与Cdt1相互作用,并发表其空间结构，目前已解析Mcm6-Cdt1相互作用结构域的复合物结构。本项目计划利用结构学研究得到的信息，体外组装爪蟾Mcm2-7复合物，在爪蟾卵提取物中研究Mcm6-Cdt1相互作用对于pre-RC的装配是否具有决定性意义以及对DNA复制的影响，有望阐明Cdt1引导Mcm2-7复合物结合于染色质的分子机理。

DNA复制是生命科学领域的研究重点和热点，该过程是一个非常复杂的酶学过程，需要多种酶和蛋白质协同作用，DNA复制起始阶段是DNA复制的关键过程，需要多种蛋白以及蛋白复合物准确的在复制原点装配。在Cdt1的作用之下，Mcm2-7复合物装配于染色质，从而完成pre-RC的装配，标志着DNA复制起始阶段的完成。Mcm2-7复合物是由六个蛋白组成的复合体，其分子量巨大，结构复杂，在DNA复制过程中起解链酶的作用。Cdt1采取何种方式把如此巨大的复合物导向染色质在分子机理层面仍然没有被阐明。鉴于Mcm6-Cdt1之间存在较强的相互作用，研究其相互作用将有助于揭示Mcm2-7复合物如何装配于染色质，从而起始DNA的复制有重要意义。.本项目从研究蛋白-蛋白相互作用入手，在前期的工作基础上，通过构建一系列突变体并选取爪蟾卵提取物研究Cdt1与Mcm2-7各亚单位之间的相互作用以及Mcm6-Cdt1相互作用对Mcm2-7复合物装配到染色质上的影响，拟解决以下科学问题：.1. 在Mcm2-7复合物当中，Cdt1是否只能与Mcm6存在显著的相互作用以及证明Mcm2是否与Cdt1有相互作用。.2. 研究如果打断Cdt1与Mcm6的相互作用，是否影响Cdt1与Mcm2-7复合物形成更大的复合物。从而在一定层面证明Mcm6-Cdt1相互作用的重要性。.3. 尽管Cdt1与Mcm6存在较强的相互作用，但是该作用的生物学意义至今仍然没有被报道。我们推断该相互作用将引导Mcm2-7复合物结合在染色质上面，从而完成pre-RC的组装，为基因组DNA的复制做好准备。本项目的研究结果将验证该假想的正确性，阐明Cdt1与Mcm6相互作用的意义。..针对拟解决的科学问题，科学设计相应的实验路线，取得主要研究成果如下: .1. 发现Cdt1上面参与Cdt1-Mcm6相互作用的氨基酸，证明Cdt1与除Mcm6之外的Mcm2-7复合物各亚单位没有直接的相互作用。.2. 证明Cdt1以及Mcm6上面参与两者相互作用的关键氨基酸的突变,会影响Cdt1与Mcm2-7复合物形成更大的复合物。.3. 通过分别构建Cdt1以及Mcm6的突变体，证明打断Cdt1-Mcm6之间的相互作用，导致Mcm2-7复合物无法结合于染色质，从而影响pre-RC的形成。