脓毒症时肾上腺TLR4表达下调导致胆固醇酯储存量下降以及肾上腺皮质功能储备低下的机制研究

肾上腺维持正常的糖皮质激素分泌首先要保证细胞内脂滴中储存有足够的胆固醇酯来提供合成底物。我们发现脓毒症大鼠肾上腺内脂滴含量和TLR4表达均明显减少；此外TLR4基因功能缺失突变的C3H/HeJ小鼠较之对照小鼠肾上腺皮质脂滴含量也减少，ACTH刺激下皮质酮分泌量降低，同时肾上腺组织中众多与胆固醇代谢相关的基因表达也发生了相应改变。在此基础上，本项目首先将通过在体和离体实验证实TLR4在维持肾上腺皮质正常反应性和胆固醇代谢中的关键作用。进而还将构建特异性靶向肾上腺皮质的TLR4腺病毒载体，观察提高肾上腺局部TLR4表达能否改善TLR4基因突变、基因敲除以及脓毒症模型的肾上腺皮质功能储备。最后还将研究TLR4是否通过调节核受体转录因子PPARs和LXRs表达和功能而影响肾上腺皮质功能。本项目研究将有助于阐明TLR4调节肾上腺皮质储备功能的分子机制，还可为临床治疗相对性肾上腺功能不全提供新思路。

肾上腺功能不全是影响脓毒症预后的关键问题，然而其发生机制尚未阐明。本课题以我们已建立的内毒素血症小鼠为模型，首先采用外源性 ACTH刺激实验证实该模型确实存在肾上腺反应性低下、发生了肾上腺相对功能不全。进一步研究表明，内毒素血症小鼠肾上腺内脂滴含量和 TLR4表达均明显减少，与肾上腺反应性低下相关；此外 TLR4基因功能缺失突变的 C3H/HeJ小鼠较之对照小鼠肾上腺皮质脂滴含量也减少，ACTH刺激下皮质酮分泌量降低，同时肾上腺组织中众多与胆固醇代谢相关的基因表达也发生了相应改变，而肾上腺局部注射TLR4腺病毒则可部分逆转内毒素诱导的肾上腺皮质细胞脂滴减少和肾上腺功能不全的现象。上述结果提示内毒素抑制肾上腺皮质细胞TLR4表达是肾上腺皮质细胞内胆固醇转运、代谢障碍、进而发生反应性降低的重要原因之一。已有研究发现TLR4表达受组织局部氧化应激(oxidative stress)和硝化应激(nitrative stress)水平的影响，我们的研究则表明内毒素可以促使肾上腺局部氧化应激和硝化应激水平升高。因此，我们进一步观察了内源性抗氧化气体分子硫化氢(H2S)和已知具有抗氧化和硝化应激作用的天然活性物质白藜芦醇（resveratrol）对内毒素血症小鼠肾上腺皮质功能的影响。结果表明内毒素可以抑制小鼠肾上腺皮质中H2S合成酶表达及H2S的生成，同时促进诱导性一氧化氮合酶(iNOS)的表达及一氧化氮(NO)的生成，从而促使肾上腺皮质发生氧化应激和硝化应激，进而引起线粒体损伤，最终导致肾上腺皮质反应性下降。而H2S供体和白藜芦醇均具有显著抗线粒体氧化应激和抑制NO生成的作用，同时可显著逆转内毒素诱导的肾上腺皮质TLR4和ACTH受体下调的效应，从而使内毒素诱导的肾上腺皮质功能不全得以明显改善。此外，近年来研究表明H2S和NO都可修饰靶蛋白半胱氨酸上的巯基，分别形成S-硫巯基化和S-亚硝基化蛋白而调节其功能。我们进一步采用质谱技术获得了可能被S-硫巯基化的靶蛋白信息，其中F0F1-ATP合酶、VDAC1和P450scc这三种蛋白已知在线粒体功能维持和糖皮质激素合成中起关键作用。NO已被证实可通过S-亚硝基化修饰F0F1-ATP合酶和VDAC1、并抑制其功能。那么，H2S和NO是否确实通过对这三种线粒体蛋白巯基修饰而实现对肾上腺皮质功能的调节作用呢？这一潜在作用机制值得我们进行深