IGF-I对氟诱导成骨细胞凋亡的保护机制

近年来本课题组通过细胞生物学方法进行氟对成骨细胞(OB)细胞因子表达的影响研究，初步发现氟抑制OB IGF-I表达，但其作用的机制至今还不得而知。因此，本项目旨在：①建立OB原代培养模型，适量的IGF-I和氟同时作用于OB，观测OB的增殖分化过程；②通过激光共聚焦观察细胞骨架结构，用实时荧光定量PCR和Western-blot对IGF-I基因、蛋白信号进行克隆、测序和表达；③通过透射电镜和流式细胞技术，研究氟促进成骨细胞凋亡的特征和IGF-I对成骨细胞凋亡的保护过程；④利用电子顺磁共振波谱仪测定OB自由基的变化；⑤从PI3K/Akt途径探讨氟下调OB IGF-I基因和IGF-I上调OB IGF-I基因表达以及OB增殖分化的内在机理。阐明IGF-I对氟诱导成骨细胞凋亡的保护机理，从而为IGF-I应用于临床防治氟骨症提供依据。

氟的过量摄入导致氟骨症，但氟的骨损伤机制尚不完全清楚。在骨代谢过程中类胰岛素生长因子-I（IGF-I）及其受体（IGF-IR）起着非常重要的作用。适量的硒有利于骨的形成，过量的硒可以产生毒性作用，它对成骨细胞中细胞因子IGF-I和IGF-IR的影响也不得而知。本研究通过成骨细胞的分离培养，并向成骨细胞添加不同剂量的氟化钠（10-6、10-5、10-4、5×10-4mol/L）和亚硒酸钠（1×10-8、1×10-7、1×10-6、5×10-6和1×10-5mol/L），作用不同的时间，采用荧光显微镜、透射电镜及流式细胞仪检测DCF的荧光强度来测定细胞内的ROS水平，采用DAPI荧光染色的方法和Annexin V/PI荧光双染色的方法检测氟致成骨细胞凋亡的程度，采用荧光定量PCR和Western blot检测IGF-I和IGF-IR基因和蛋白水平，采用小RNA干扰的方法检测IGF-I和IGF-IR在硒致小鼠成骨细胞增殖和凋亡中所起的作用，通过检测氟化物对成骨细胞的氧化应激损伤、IGF-I蛋白表达水平、成骨细胞结构、细胞周期、细胞骨架和细胞凋亡的影响，探讨IGF-I对氟化物致骨骼成骨细胞凋亡的保护机制。体外实验结果表明氟化钠抑制小鼠原代培养的成骨细胞的增殖和IGF-I的蛋白表达，细胞内活性氧水平升高，诱导成骨细胞停滞在S期和凋亡。较高浓度的硒（5×10-6mol/L和1×10-5mol/L Na2SeO3）抑制成骨细胞活性，而低浓度的硒（1×10-8和1×10-7mol/L Na2SeO3）促进成骨细胞的增殖。扫描电镜和流式细胞术检测凋亡的结果显示，较高浓度的硒促进成骨细胞的坏死和凋亡。基因和蛋白检测表明，较高浓度的硒明显抑制IGF-1R基因和蛋白的表达，低浓度的硒促进其基因和蛋白的表达。siRNA干扰检测结果显示，同一浓度的亚硒酸钠，干扰组的MTT活性要低于未干扰组。caspase-3的活性检测中，干扰组要高于未干扰组。由此可以推断出由于硒对成骨细胞的增殖和凋亡的影响是通过IGF-IR起作用的，氧化应激和IGF-I蛋白表达降低而使氟化钠抑制成骨细胞增殖，诱导成骨细胞凋亡。进而可以得出，过量的氟在与骨骼疾病相关代谢异常和降低成骨细胞存活的过程起着极其重要的作用。本项目发表论文9篇，其中SCI收录9篇，累计IF=21.432。培养已毕业的博士生3名，已毕业的硕士生2名。