三联Mtb噬菌体溶菌蛋白共表达的重组活疫苗靶向治疗潜伏感染结核的实验研究

结核杆菌(Mtb)潜伏感染已成为结核病防治的巨大障碍，与结核病久治不愈、复发播散、多药耐药产生密切相关。基于当前现有抗结核药物不能有效杀灭胞内潜伏Mtb的困境，课题拟以Mtb细胞壁为靶标，以噬菌体溶菌蛋白的杀菌高特异性与高效性为导向，构建一种具有集成靶向治疗效果的新型基因治疗活疫苗，用于对胞内潜伏感染Mtb的彻底根治。该疫苗以减毒耻垢分枝杆菌为生物载体，携带并靶向递送Mtb噬菌体三联溶菌蛋白到巨噬细胞中表达，对潜伏胞内的Mtb进行多靶点高效特异裂解杀灭；与此同时，减毒耻垢分枝杆菌还可发挥本身具有的免疫激活效应，从而获得对潜伏感染Mtb基因治疗与免疫治疗叠加的综合治疗效果。.该活疫苗安全、高效，综合了基因治疗与免疫治疗的优势，其杀菌机理与Mtb是否耐药菌株无关，是否增殖或休眠无关，为探索解决结核病和其它细胞内病原菌感染的胞内潜伏、多药耐药等棘手问题，开创了全新思路。

背景与目的： .目前全球至少有20亿人存在结核杆菌的潜伏感染（latent tuberculosis infection, LTBI）。潜伏结核感染已成为结核病防治中的一个巨大障碍。如何有效地根治LTBI已经成为当前结核病防治工作中必须面对的难题。.方向：结核病的治疗。.主要研究内容： .构建Mtb噬菌体LysinA、LysinB/Holin原核表达载体并制备活性蛋白及多克隆抗体；在含有分枝杆菌属OriM复制子的真核共表达质粒pZM0M基础上构建噬菌体LysinA-LysinB/Holin真核共表达质粒pZM0A并检测其在Mφ内的有效表达；将pZM0A电转化入耻垢分枝杆菌载体中，鉴定正确后，大量扩增该重组治疗性活疫苗；细胞水平检测该活疫苗对治疗性基因的靶向递送、表达、对巨噬细胞（macrophage, Mφ）内Mtb的杀伤效果及对细胞的可能毒副作用；建立活动性结核感染模型及潜伏结核感染模型，动物实验评价该治疗性活疫苗对结核感染的治疗作用；用高通量基因芯片/荧光定量PCR研究潜伏感染患者外周血CD4+T细胞内miRNAs、mRNAs和lncRNAs的差异表达与涉及的信号通路。.重要结果与关键数据：.成功构建了Mtb噬菌体LysinA、LysinB/Holin原核表达载体，制备了活性蛋白及获得了高质量的兔源多克隆抗体；在含有分枝杆菌属OriM复制子的真核共表达质粒基础上，成功构建了结核分枝杆菌噬菌体LysinA-LysinB/Holin真核共表达质粒pZM0A；pZM0A携载的分枝杆菌噬菌体LysinA-LysinB/Holin能成功在巨噬细胞内表达且具有明显的杀菌效果；细胞水平的结果表明，携载pZM0A的耻垢分枝杆菌重组治疗性活疫苗具有良好的巨噬细胞靶向性，对正常巨噬细胞无明显毒副作用，且具有良好的杀菌效能；动物实验结果表明，重组治疗性活疫苗对结核感染小鼠有非常显著地治疗杀菌效果，能明显刺激结核感染小鼠的脾淋巴细胞增殖，能显著增加细胞因子IFN-γ，TNF-α的含量，同时对小鼠本身无明显毒副作用；潜伏结核感染组外周血CD4+T有多个miRNA和lncRNA的表达发生了变化，预测靶基因集合显著富集于局部黏附信号通路、细胞外基质-受体相互作用、MAPK信号通路等方面。.科学意义：.本课题构建的新型结核治疗性活疫苗以耻垢分枝杆菌为生物载体，携带并靶向递送Mt