新候选抑癌基因INPP4B在胃癌中的功能及其分子机制研究

Gastric cancer is one of the leading causes of cancer-related deaths in china because of its poor prognosis. In ours previously studys, LOH at chromosomes 4q were analyzed in gastric cancer,pure normal and cancer cell populations were procured selectively by laser capture microdissection and extracted DNA was amplified with polymorphic microsatellite markers spanning the region of interest. Deletion mapping indicated that 4q13.3-4q22.3，4q31.21-4q32.2，4q32.2-4q34.3. We screened these regions by SAGE analysis of CGAP.These experiments identified INPP4B at 4q31.2 maybe a candidate TSG involved with gastric cancer.Immunohistochemical staining and Real time RT-PCR showed that expressions of INPP4B wes less frequent in clinical cancer sample and gastric cell lines compared with that in normal sample. Down-regulation of INPP4B expression is significantly associated with depth of invasion,lymph nodes metastasis.In this study,we sought to investigate the role of INPP4B in gastric cancer, explore the effect of INPP4B gene on the migration and invasion of gastric carcinoma cells. Furthemore, the molecular mechanism of down-regulated expression of INPP4B protein in gastric cancer will be investigate using LOH analyse, promoter methylation, as well as DNA sequencing for mutation.The results of the present study will be valuble for further investigations of effective prevenion and treatment of gastric cancer.

我国是胃癌的高发区，胃癌严重地危害着国人的健康。在前期实验中，我们利用杂合性丢失分析确定了染色体4q区域内的最小丢失区域，并在其中鉴定出与胃癌密切相关的候选抑癌基因INPP4B。经临床标本及胃癌细胞株验证，INPP4B基因在胃癌组织中存在着显著地丢失和表达下降，而且与胃癌的侵润深度、淋巴结转移等密切相关。本项目拟进一步探讨INPP4B基因在胃癌发生发展过程中的作用，失活机制，对PI3K/Akt通路的影响，以及调控INPP4B的分子机制，为今后有效的防治胃癌，探索新的分子靶点和理论基础。

本研究在前期工作的基础上，系统地研究了新候选抑癌基因INPP4B在胃癌中的可能失活机制。我们的结果提示不同于经典的抑癌基因，INPP4B基因的主要失活机制并不是杂合性丢失与点突变。启动子超甲基化可能是其失活的重要原因。另外，我们又利用组织芯片与原位杂交，考察了301例胃癌患者中INPP4B表达与EB病毒感染的关系，36例EB病毒阳性的标本中，29例INPP4B蛋白表达下降，占80.6%。经Fisher’s确切概率法检验，EB病毒感染与INPP4B蛋白表达之间存在显著的统计学相关性（P<0.05）。本部分研究结果，首次发现了INPP4B蛋白与EB病毒相关胃癌的潜在关系，为进一步阐明EB病毒相关胃癌的分子生物学特点及发病机制，提供了重要参考。我们推测，EB病毒感染胃粘膜细胞后，导致的DNA超甲基化状态，促进了INPP4B基因的失活，从而丧失了对PI3K/Akt信号通路的抑制作用，加速了胃癌的演变过程。我们将继续深入研究这一发现。本研究还从体外、体内的环境下，考察了INPP4B基因的不同表达状态对胃癌细胞生长和侵袭能力的影响。我们构建了siRNA表达质粒和阴性对照质粒，经脂质体转染SGC7901细胞。MTT检测及Transwell实验发现，INPP4B被沉默后，SGC7901细胞的增殖侵袭能力显著增强。而将表达质粒转染至INPP4B表达阴性的MGC-803细胞后，MGC-803细胞的增殖能力则显著减弱（P<0.05）。裸鼠实验中，分别将siRNA干扰稳定转染细胞株、INPP4B表达细胞株，注射入裸鼠体内，2周后，解剖观察腹膜种植成瘤情况。结果显示，空白对照与阴性对照组在转移瘤总重量上无统计学差异，而实验组与阴性对照组间存在显著的统计学差异。. 综上所述，我们的研究初步揭示了INPP4B基因在胃癌细胞中可能的失活机制，并证明了INPP4B对胃癌细胞的增殖与侵袭能力起到一定的作用。同时，我们首次发现了INPP4B表达与EB病毒感染之间可能存在着联系，可能为进一步揭示EB病毒相关性胃癌的发生机制，提供重要的参考。