新候选抑癌基因VEZT在胃癌中的功能及其表观遗传学调控研究

VEZT基因是本课题组新近提出的胃癌候选抑癌基因，前期研究发现人胃癌细胞株和胃癌组织中VEZT的表达显著低于正常胃粘膜上皮细胞和癌旁正常组织，VEZT基因启动子在正常胃粘膜细胞呈低甲基化而在胃癌细胞呈高甲基化状态。为进一步明确VEZT在胃癌发生发展的作用及其表达调控机制，因此本项目拟首先通过研究VEZT基因在胃癌组织的表达分析其与临床病理特征的关系；并通过构建VEZT基因真核表达载体、siRNA干扰载体和裸鼠胃癌模型等方法阐明调控VEZT基因表达对胃癌细胞的增殖及侵袭等恶性生物学特征的影响；通过5－氮杂2－脱氧胞苷及曲古抑菌素A处理对VEZT表达影响等实验获得调控其表达的可靠证据，并在临床胃癌标本中研究VEZT甲基化与胃癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系，明确其与临床胃癌预后的关系。该研究将对进一步揭示胃癌发病的分子机制、设计合理的治疗药物及判断预后提供更充分的科学依据。

目的：VEZT基因是本课题组新近提出的胃癌候选抑癌基因，前期研究发现人胃癌细胞株和胃癌组织中VEZT的表达显著低于正常胃粘膜上皮细胞和癌旁正常组织，VEZT基因启动子在正常胃粘膜细胞呈低甲基化而在胃癌细胞呈高甲基化状态。为进一步明确VEZT在胃癌发生发展的作用及其表达调控机制，因此本项目拟：1)研究VEZT基因在胃癌组织的表达分析其与临床病理特征的关系；2)构建VEZT基因真核表达载体和裸鼠胃癌模型等方法阐明调控VEZT基因表达对胃癌细胞的增殖及侵袭等恶性生物学特征的影响；3)通过5－氮杂2－脱氧胞苷及曲古抑菌素A处理对VEZT表达影响等实验获得调控其表达的可靠证据; 4)观察过表达VEZT对胃癌细胞体外增殖、侵袭迁移能力和成瘤能力的影响；5) VEZT基因对胃癌细胞影响的机制。.方法： ① 用real-time PCR方法检测VEZT基因在胃正常黏膜上皮细胞和胃癌细胞的表达情况。 ②亚硫酸盐测序PCR和甲基化特异性PCR对VEZT甲基化情况的分析。③用RT-PCR扩增VEZT cDNA全长片段，经过酶切测序验证后装入pEGFP-N1真核表达载体，再次酶切测序验证。④载体转染VEZT胃癌细胞，转染观察VEZT对胃癌细胞增殖、侵袭、迁移和克隆形成的影响。⑤VEZT在裸鼠体内皮下成瘤能力的研究。⑥表达谱芯片技术结合定量PCR和染色质免疫共沉淀实验探讨可能的分子机制。.结果： ① real-time PCR结果显示VEZT基因在胃正常粘膜上皮呈现高表达，而在胃癌细胞株中低表达或不表达。② VEZT基因启动子区呈高甲基化。③幽门螺旋杆菌感染影响VEZT基因启动子区甲基化。 ④成功构建VEZT的真核表达载体并转染胃癌细胞株。通过G418筛选出稳定表达VEZT的细胞，real-time PCR和Western blot方法证实实验组VEZT基因表达上调。⑤ VEZT的高表达抑制胃癌细胞的侵袭、迁移、小管形成、细胞增殖实、克隆形成和裸鼠肿瘤形成。⑥VEZT基因直接靶向GPR56基因、CDC42基因, TCF19基因。⑦VEZT基因表达与胃癌患者淋巴结转移、癌细胞侵润深度和TNM分期密切相关而与性别、年龄。肿瘤大小、细胞分化、肿瘤部位和远处转移无关。.结论： VEZT基因是一个与胃癌相关新的抑癌基因。其表达与胃癌患者转移和预后密切相关。