沙眼衣原体pORF5蛋白功能及其与宿主细胞相互作用的研究

pORF5是申请者首次发现由沙眼衣原体基因编码并分泌到宿主细胞胞浆的一种分泌性蛋白。我们的前期工作已发现细胞胞浆分泌的pORF5蛋白能迅速被宿主细胞中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶磷酸化，转基因过表达或抑制pORF5蛋白功能证实pORF5与衣原体发育周期、包涵体的形成相关。因此，本课题拟采用分子生物学技术、杂交瘤技术制备pORF5单链抗体；采用细胞内抗体技术系统地干扰该蛋白的功能，利用蛋白质组学技术、细胞生物学技术分析阻断pORF5蛋白功能前后沙眼衣原体感染细胞中蛋白质在表达数量和修饰状态上的差异及细胞生物学行为的改变，综合评价pORF5蛋白功能及其与宿主细胞蛋白之间的相互关系，揭示衣原体通过分泌pORF5蛋白介导衣原体与宿主细胞的相互作用并在泌尿生殖道持续性感染过程中的可能性分子机制及其网络调控机制，从而为衣原体疾病的预防、诊断和治疗提供重要的理论和实验依据。

pORF5是申请者在国际上首次发现由沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis, Ct）质粒蛋白基因编码并分泌到宿主细胞胞浆的一种分泌性蛋白。为阐明pORF5蛋白功能并鉴定其是否与宿主细胞蛋白发生相互作用，本研究采用分子生物学技术构建了pDSRed-C1/pORF5真核表达重组体，建立了pORF5基因转染的HeLa-229细胞转染株，发现转pORF5基因胞浆表达pORF5不会影响Ct感染率；采用杂交瘤技术制备pORF5抗体，共获得了6株抗体分泌稳定的杂交瘤细胞株（2h4、5e5、10g4、2d12、4e6、9c8）；构建了pGEX-6p/pORF5原核表达重组体，制备了高纯度可溶性的pORF5融合蛋白，融合蛋白经蛋白酶酶切后制备了不含GST标签的pORF5蛋白，将纯化的pORF5蛋白体外刺激细胞，采用细胞生物学技术分析pORF5蛋白对细胞的影响，结果发现：pORF5蛋白能激活宿主细胞p38/MAPK、ERK/MAPK通路，并诱导宿主细胞产生IL-8、IL-1β 和 TNF-α等前炎症因子，同时证实pORF5蛋白通过激活宿主细胞模式识别受体TLR2诱导IL-8、IL-1β 和 TNF-α等前炎症因子的产生；进一步将纯化的pORF5蛋白接种于小鼠阴道后穹窿，体内实验发现pORF5蛋白能引起小鼠输卵管肿胀，生殖道局部增殖有大量的淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、浆细胞及巨噬细胞等炎性细胞浸润，炎症病理积分明显高于对照组，血清及阴道分泌物中存在较高水平的TNF-α、IL-1β、IL-6等前炎症因子。提示pORF5蛋白在Ct泌尿生殖道持续性感染的过程中可能发挥重要作用。本项目的研究可为衣原体疾病的预防、诊断和治疗提供重要的理论和实验依据。