球孢白僵菌四个转录因子调控线粒体膜蛋白基因Ohmm介导氧化胁迫反应的机制

Oxidative stress is one of the vital adverse stresses for fungal pathogens, which directly impedes pathogenesis and environment adaption. Mitochondria are associated with stress response, such as oxidative stress response. It is demonstrated that mitochondrial function has been involved in HOG1 MAPK pathway. However, the regulatory mechanism of HOG1 MAPK pathway mediating mitochondrial function is still unclear. We recently found that a downstream gene of HOG1 MAPK pathway, Ohmm, encodes a mitochondrial membrane protein that negatively mediates oxidative stress response and virulence in the insect fungal pathogen, Beauveria bassiana. To understand the mechanism of transcription regulation of Ohmm that mediates oxidative stress response, we identified four transcription regulators of Ohmm gene, all of which were involved in oxidative stress response and virulence. The findings suggested a valuable cue to explore the mechanism of HOG1 MAPK pathway controlling oxidative stress response via mediating mitochondria function in the fungal pathogen. In this project, qRT-PCR, yeast-one hybrid, protein co-immunoprecipitation (CO-IP), and bimolecular fluorescence complementation (BiFC) strategies, as well as transcriptional activity detection method, will be adapted to reveal relationship of these transcription factors (TFs) in regulating transcription of Ohmm gene, and the interaction of the TFs and HOG1 MAPK in B. bassiana. Furthermore, other genes regulated by the crucial transcription factors will be indentified and characterized using comparative transcriptome analysis, CHIP-PCR and gene disruption methods. One of our goals of the project is to expect to achieve a new breakthrough on understanding the regulatory mechanism of HOG1 MAPK controlling oxidative stress response via mediating mitochondria function in B. bassiana. Another goal is to hope to provide a theoretical basis for enhancement of oxidation resistance and virulence of the fungal agent using genetic engineering.

氧化胁迫是病原真菌面临的重要逆境胁迫，直接影响病原菌侵染致病及环境适应性。线粒体参与氧化等逆境胁迫反应，其功能与HOG1 MAPK信号途径密切相关，但二者的关联机制尚不明晰。课题组发现，昆虫病原真菌球孢白僵菌HOG1 MAPK途径的一个下游基因Ohmm编码蛋白定位于线粒体膜，介导线粒体功能，影响氧化胁迫反应和毒力。为揭示Ohmm介导氧化胁迫反应的调控机制，我们分离鉴定了Ohmm上游四个转录因子，发现这四个转录因子均介导氧化胁迫反应和毒力。这些研究积累为揭示HOG1途径介导线粒体功能调控氧化胁迫反应和毒力的机制提供了新线索。本项目拟进一步解析四个转录因子作用于靶标基因Ohmm的相互关系，探明转录因子与上游HOG1 MAPK的关系，鉴定转录因子的其它靶标基因。项目的完成，有望在揭示HOG1 MAPK途径介导线粒体功能调控氧化胁迫反应的机制方面取得突破，同时为提升生防真菌应用效果提供理论指导。

氧化胁迫反应与病原真菌致病性密切相关。病原真菌氧化胁迫反应基因受一系列功能部分冗余的信号途径及转录因子紧密调控。然而，除真菌中保守的信号途径及转录因子外，其它转录因子及信号途径调控氧化胁迫反应，鲜有报道。课题组前期发现，昆虫生防真菌球孢白僵菌Hog1 MAPK的一个下游基因编码的线粒体膜蛋白BbOhmm负介导氧化胁迫反应和毒力。为解析BbOhmm基因的转录调控机制，课题组分离鉴定了四个在氧化胁迫条件下结合于BbOhmm启动子元件的蛋白。本课题以四个调控蛋白为线索，解析其作用于靶标基因的相互关系及其与Hog1 MAPK的关系，鉴定转录调控因子的其它靶标蛋白。课题组研究发现，四个调控蛋白中的三个蛋白具有DNA结合结构域和转录因子活性，均为Zn2Cys6类转录因子，命名为OsrR1、OsrR2和OsrR3。EMSA检测和ChIP-qPCR分析发现，三个转录因子均可结合BbOhmm基因启动子区，但仅OsrR2显著富集在启动子区，其富集量着氧化胁迫而增加。RT-qPCR分析发现，三个转录因子缺失不同程度的影响BbOhmm基因的表达，但缺失OsrR2中BbOhmm基因表达显著上调，且受氧化胁迫的影响，表明OsrR2在调控BbOhmm基因转录中扮演了主要角色。结合RNA-seq和ChIP-seq分离三个转录因子调控的靶基因，发现OrsR1直接调控抗氧化和转录活性基因，包括OsrR2和另一个调控因子细胞周期类蛋白Clp1基因。Clp1定位于细胞核，通过介导核糖体生物合成、RNA加工和代谢基因，负介导氧化胁迫反应。OsrR2和OsrR3除调控不同的抗氧化和解毒基因外，直接靶向不同的组分调控Fus3-MAPK途径。扫描转录因子靶基因启动子的ChIP-seq峰或结合基序，发现三个转录因子在一些包括BbOhmm在内的靶基因启动子的结合基序聚集且部分重叠。Co-IP研究结果表明，OsrR2、Clp1和OsrR3形成一个复合体，而且发现四个调控的转录谱具有高度关联性。由此表明，四个调控因子形成一个新的调控网络，其中OsrR1通过负调控OsrR2和Clp1基因转录调控OsrR2-Clp1-OsrR3复合体，并伴随或松散结合复合体，调控一些包括BbOhmm在内的氧化胁迫反应基因。此外，研究发现，三个转录因子基因转录不同程度的受Hog1-MAPK途径的影响，但OsrR2的转录严格受其调控。