柴胡属药用植物的系统发育基因组学和超级条形码研究

China is one of the Bupleurum bioadversity center. Abundant taxa at and below specific level have been acknowledged so far. This leads to uneven quality of Chaihu crude drug and a disordered market supply. It's still necessary to exploit accurate means for species identification. The systematic status of the genus, intrageneric relationships, and species delimitation are as well in debate. Along with the development of sequencing technology, phylogenomics dealing with phylogenetic relationships of organisms based on large scale molecular data at genomic level such as whole chloroplast genome provides us a possible resolution to these issues. The whole genome suquences or full length gene can provide more genetic information and thus higher species resolution ability than single gene fragment or fragment combinations. Furthermore, the sequencing of genome as chloroplast scale can be fulfilled in a short time at a relative low cost currently. So in this forthcoming study, the proposers are going to continue focusing on Bupleurum plants, clarifying their whole chloroplast genome and full length nuclear ribosomal DNA sequences by means of high-throughput sequencing, to perform phylogenomic analysis of the genus, and to inspect the significance of ultra-barcoding combining cpDNA and nrDNA sequences in species discrimination and consanguinity research, with the aim of settling the disputes mentioned above. The study is expected to provide new insights to Bupleurum phylogeny and taxonomy, and to provide new solution to accurate identification of the source of Chaihu.

我国是柴胡属植物多样性中心之一，属内物种众多，有较多种下单位，鉴定难度大，造成中药柴胡质量参差；其系统学地位、属内亲缘关系及某些物种的界定等也存在争议。随着测序技术的发展，在基因组水平上用如叶绿体基因组等大规模的分子数据研究生物之间的系统发育关系的系统发育基因组学，为解决上述问题提供了可能。这些基因组全序列或一些基因的全长序列可比单个基因片段或片段的组合包含更多的遗传信息，有更高的物种分辨率；其测定目前可以较低的费用，在较短的时间内完成。因而在本项目中，申请者拟在前期工作的基础上，利用高通量测序技术，获得柴胡属植物叶绿体全基因组序列和全长核核糖体DNA序列，进行本属植物的系统发育基因组学分析，并考察两者联用的超级条形码在物种鉴定和亲缘关系研究中的意义，以期解决柴胡属系统发育和物种鉴定中存在的问题。研究可为柴胡属植物的系统学和分类学提供新资料，并为柴胡类药材基原的准确鉴定提供新思路和新方法。

我国是柴胡属植物多样性中心之一，属内物种众多，有较多种下单位，鉴定难度大，造成中药柴胡质量参差；其系统学地位、属内亲缘关系及某些物种的界定等也存在争议。随着测序技术的发展，在基因组水平上用如叶绿体基因组等大规模的分子数据研究生物之间的系统发育关系的系统发育基因组学，为解决上述问题提供了可能。在本项目中，申请者在前期工作的基础上，利用高通量测序技术，获得柴胡属植物叶绿体全基因组序列和全长核核糖体DNA序列，对本属植物进行了系统发育基因组学分析，并考察两者联用的超级条形码在物种鉴定和亲缘关系研究中的意义。从15个省市区共采集了柴胡属植物31种，5变种，1变型，标本100余号300余份，占我国柴胡属全部种类的85%以上，共100余个样品。完成了天山柴胡、簇生柴胡、三辐柴胡、多脉柴胡、紫花鸭跖柴胡、纤细柴胡、有柄柴胡、马尾柴胡、西康柴胡等未有生药学研究报道的柴胡属植物的地下部分和地上部分的性状描述、横切面组织结构观察、粉末特征观察，以及根中柴胡皂苷a、d的含量测定。将黄花鸭跖柴胡根的横切面结构与紫花鸭跖柴胡、小叶黑柴胡的根横切面结构进行了比较，认为黄花鸭跖柴胡与小叶黑柴胡的结构更为接近，而与紫花鸭跖柴胡有所不同，支持将黄花鸭跖柴胡作为黑柴胡的变种处理。另进行有柄柴胡和细叶有柄柴胡、空心柴胡和川滇柴胡等系统关系有争议的物种的组织结构的比较观察。完成了100余样品的高通量测序工作，每个样品数据量约为3Gb；对叶绿体基因组和nrDNA成功进行了组装和注释。根据系统发育树，我们得出如下信息：1.确证了柴胡属为单系类群。2.柴胡属与西风芹为姊妹群关系，位于芹亚科。3.国产柴胡属植物集合为一个大的类群，下分为两个较大的类群；对每个类群的物种间关系进行了分析。从待鉴定的北柴胡样品中提取DNA，进行高通量测序，用genome-skimming法拼接出叶绿体基因组序列，与北柴胡、狭叶柴胡、大叶柴胡等物种叶绿体基因组序列，进行邻接法建树；样品与北柴胡成功聚类为一支，初步验证了超级条形码鉴定的可行性。并建立了柴胡皂苷的时间分辨免疫荧光分析法，可快速进行生药中柴胡皂苷的含量测定。