淫羊藿属药用植物超级条形码及其分类学研究

It is difficult to distinguish medicinal plants in Epimedium because of the blurred boundaries between species, resulting in confusion of medicinal species and presence of drug safety risks. At present, we have collected 63 samples from 22 species in Epimedium, and our research have indicated that standard DNA barcodes could not identify species in Epimedium. We propose that chloroplast genome, as a super-barcode, can solve the problem from identification and taxonomy of medicinal plants in Epimedium in China. We have grasped PacBio single molecule DNA sequencing technology in the previous study. In this project, we will use the technology to obtain complete chloroplast genome sequences of all species in Epimedium in China. SNPs intensive area（5-10k） will be gained by further analysis. Moreover, we will use separately sequences from SNPs intensive area and complete chloroplast genome sequences as super-barcodes to identify species in Epimedium. The ability of the two super-barcodes to distinguish species in Epimedium will be clarified through the analysis of intra- and inter-species divergences and identification efficiency; Phylogenetic analyses using maximum likelihood and Bayesian inference were performed with sequences from SNPs intensive areas and complete chloroplast genome sequences, which will be used to confirm the taxonomy of medicinal plants in Epimedium. This project will provide theoretical basis for the identification and taxonomy of medicinal plants in Epimedium.

淫羊藿属植物种间界限模糊，分类鉴定困难，导致药材品种混乱，用药安全存在隐患。课题组已采集淫羊藿属22个物种63个样品，研究表明采用通用DNA条形码序列难以区分淫羊藿属物种。本项目提出利用叶绿体基因组作为超级条形码解决中国淫羊藿属物种分类鉴定学术假设。课题组前期已熟练掌握PacBio单分子测序技术，本项目将采用该技术获得中国淫羊藿属所有物种的叶绿体全基因组序列，进一步分析筛选出基因组SNPs密集区（5-10k），分别将SNPs密集区序列和叶绿体基因组全序列作为超级条形码，分析同一物种内、不同物种间的遗传距离，计算两组序列对淫羊藿属物种的鉴定成功率，阐明它们对淫羊藿属物种的鉴定能力；分别基于SNPs密集区序列和叶绿体基因组全序列，运用最大似然法和贝叶斯法构建淫羊藿属物种的系统发育树，分析淫羊藿属物种间的系统进化关系，证实属下物种分类。本项目将为解决淫羊藿属物种分类鉴定问题奠定坚实理论基础。

淫羊藿属是植物分类的难点类群，属下分类一直存在争议，物种分类鉴定困难已严重威胁该属药材的安全使用，探索有效的分类鉴定方法已迫在眉睫。课题组前期研究基于遗传距离法进行淫羊藿DNA条形码鉴定研究，结果仅能鉴别7个物种。鉴于淫羊藿属物种的特殊性，本研究在前期基础上引入了BLOG分析方法，结果表明该方法较遗传距离法更适用于淫羊藿物种的鉴定分析，有效提高了普通DNA条形码的鉴定效率，可鉴定17个物种，该结果对于植物DNA条形码鉴定研究具有宝贵的借鉴意义。后续研究进一步基于叶绿体基因组开展了巫山淫羊藿及其密切相关种鉴定分类研究。结果表明叶绿体基因组不仅为鉴别淫羊藿物种提供了有用的遗传信息，也为该属的系统发育关系提供了新的证据，具有解决淫羊藿属物种鉴定分类及进化问题的潜力。因此，我们进一步扩大了研究对象，对在中国淫羊藿属分类地位上较为重要的32个物种进行叶绿体基因组测序和分析，结果获得5个高变异区（SNPs 密集区）序列，其中 accD-psaI、ndhF-rpl32 和 rpl32-trnL可高效鉴定该属物种，accD-psaI鉴定能力最强，可准确鉴别本研究所涉及的所有物种，有效解决了该属物种鉴定问题，为中药DNA条形码鉴定研究提供了新思路。叶绿体基因组水平的系统发育分析结果仍不能支持 Stearn 对 sect. Diphyllon 组下物种基于花瓣特征的分系。而我们观察到中国淫羊藿属类群的多分枝现象可能是分布地区的近期辐射造成的。淫羊藿属的共同祖先可能经历了快速的物种形成，而没有足够的时间来积累信息性突变，使得淫羊藿属的种间相似度与种内相似度接近甚至更高。在新热带雨林和 Rosa sect. Synstylae 中也观察到了类似的模式，这被归因于不完全谱系分选和基因渗入。鉴于 sect. Diphyllon 物种可能仍在分化过程中，通过深入的变异研究以记录物种分化过程对描述物种的完整性至关重要，明确物种边界可能是解决该属分类学矛盾和复杂性的前提。这些研究结果为建立自然的属下分类系统奠定了理论基础。