辅助生殖技术对小鼠脑组织及人胚胎中GABRB3基因表达的影响

The security of assisted reproductive technology (ART) is attracting more and more attention nowadays. Some reports suggested ART as a risk factor of autism spectrum disorders (ASD), but there are also reports against it. Autism is determined by multiple genes and environment. One of the candidate genes is GABRB3, which encodes beta 3 subunit of the GABA A receptor. Prepare in vivo fertilization, in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection mouse embryos. Fetus were got through natural pregnancy or embryo transfer. Compare the expression levels of GABRB3, MEPC2 and UBE3A genes in brains of three kinds of mice by RT-PCR. The effect of ART on GABRB3 gene could be inferred according to the visible results. Detect DNA methylation and histone modification status in promoter region of GABRB3 gene by bisulfite sequencing and ChIP analysis. Epigenetic changes could be reversed by epigenetic modification enzyme inhibitors. Change the medication time, dosage and duration of inhibitors, and try to investigate a method with the best inhibitory effect and minimum influence on animal. On the other hand, we investigate GABRB3 expression and chromosome 15q12 ploidy in human embryos produced by IVF or ICSI, and draw the map of GABRB3 expression during embryo development.

辅助生殖技术的安全性问题受到人们的广泛关注。有报道指出，辅助生殖技术是自闭症的一个风险因素，但也有报道反对这一说法。自闭症是由多基因和环境共同决定的，其中一个候选基因是GABRB3，它编码γ –氨基丁酸（GABA）A受体的β3亚基。制备体内受精、体外受精（IVF）和单精子注射（ICSI）小鼠胚胎，通过自然妊娠或胚胎移植得到后代。利用RT-PCR比较三种小鼠大脑组织的GABRB3基因及相关基因MEPC2、UBE3A的转录水平，根据三种基因转录水平的直观变化推断辅助生殖技术可能对GABRB3基因产生的影响。利用重亚硫酸盐测序和ChIP分析，检测三种样本GABRB3基因启动子区的DNA甲基化水平和组蛋白修饰状态。另一方面，检测发育至不同时期的IVF和ICSI人类胚胎中GABRB3基因的表达情况及其所定位的染色体15q12的倍性，得到GABRB3基因表达的时间图谱。

随着辅助生殖技术的推广，其安全性越来越受到人们的重视，体外受精（IVF）与卵胞浆内单精子注射（ICSI）等操作是否会对人类胚胎产生影响以及产生怎样的影响受到人们的广泛关注。研究发现，辅助生殖技术可能是自闭症的风险因素，但目前尚没有定论。本项目着眼于辅助生殖体外操作对后代神经系统的影响，通过建立人类辅助生殖技术的小鼠模型，研究辅助生殖后代与自然受孕后代在脑组织的基因表达方面是否存在差异，并以自闭症相关基因GABRb3、MeCP2及Ube3a作为研究重点。同时探究不同来源后代的生殖能力是否一致。.通过借鉴前人研究，我们改进了传统持卵针，建立了不依赖于PIEZO的小鼠ICSI技术并获得活产。这一方法与传统PIEZO法相比更接近人类ICSI技术，能够更准确地模拟人类ICSI过程，以通过这种方法获得的活产小鼠作为研究人类辅助生殖技术的动物模型也更具参考价值。目前这一方法的胚胎存活率为85.71%，2-细胞胚胎率为42.42%，活产率为12.50%。通过比较自然受孕、IVF及ICSI来源小鼠脑组织的基因转录模式发现，IVF小鼠及ICSI小鼠的基因转录与自然受孕小鼠有较大区别。与自然受孕小鼠相比，IVF小鼠脑组织中有1658个基因转录下调、222个基因转录上调，其中下调基因所涉及的最主要生物学过程为神经系统发育。ICSI小鼠中有175个基因下调，121个基因上调。IVF小鼠与ICSI小鼠的基因表达模式也不尽相同。对自然受孕与IVF小鼠脑组织中GABRb3、MeCP2及Ube3a基因的DNA甲基化进行测序发现，不同周龄小鼠GABRb3基因 CpG 294:298:300:302位点的甲基化程度普遍存在差异，而MeCP2和Ube3a基因的CpG位点甲基化程度无显著差异。以上结果表明，辅助生殖体外操作会对小鼠的基因转录及表观遗传修饰产生不同程度的影响，这对研究人类胚胎具有借鉴和提示作用。生殖能力测定结果显示，体外受精后代生殖能力与自然受孕后代没有显著差异。.对废弃的人类IVF及ICSI来源囊胚进行免疫荧光染色发现，GABRB3、MECP2及UBE3A三种目标蛋白中，仅MECP2表达且均匀定位于内细胞团与滋养层的细胞核内，其余两种蛋白在囊胚阶段不表达。分析荧光强度可知，两种来源囊胚中MECP2蛋白含量无显著差异。这一结果对理解三种蛋白在胚胎发育过程中的时空表达模式具有一定帮助。