辅助激活受精对小鼠生殖细胞印记基因甲基化修饰的影响及其机制研究

The assisted oocyte activation (AOA) technique is an assisted method to the failure of intracytoplasmic sperm injection. However, this activation process is a critical window of gene imprinting removal, establishment and maintenance, and is likely to affect the normal imprinting process, its security has not yet been established. The lack of animal models with assisted oocyte activation is the main obstacle to the study of human AOA safety. Our previous study has created a technique to controllable reduce the activation of the sperm and found that AOA can improve the development of embryo derived from the sperm with weak activation ability. This study, in further, intends to quantify the intensity of sperm activation, and to establish the ICSI-AOA mouse model to explore the effect of the fertilization with assisted oocyte activation on DNA methylation of imprinted genes in mouse germ cells. By detecting the expression of epigenetic modification related enzymes, and analysis of type II ICSI-AOA mouse model, it will reveal the mechanism of the effect of assisted activation on the DNA methylation modification of imprinted gene. This study will preliminary explore the risk of imprinting gene methylation in the AOA technique, and provide a new scientific guidance for the clinical application of AOA.

卵母细胞辅助激活(assisted oocyte activation, AOA)技术是对单精子卵胞浆显微注射反复受精失败的一种辅助方法，但此激活过程是基因印记去除、建立和维持的关键窗口期，很可能会影响正常的印记过程，其安全性尚未建立。严重缺乏辅助激活受精的动物模型，是进行人类AOA安全性研究的主要障碍。我们前期研究创建了可控降低精子激活力技术，并发现AOA能改善弱激活力精子受精的早期胚胎发育。本项目拟进一步量化观测精子激活力强度，构建ICSI-AOA小鼠动物模型，探索辅助激活受精对ICSI-AOA小鼠生殖细胞关键印记基因甲基化修饰的影响，通过检测表观遗传修饰相关酶的表达，及对II型ICSI-AOA小鼠模型的分析，初步揭示辅助激活受精对印记基因甲基化修饰影响的机制。本研究项目旨在初步探索印记基因在AOA技术中的甲基化修饰表观遗传印记风险，为AOA技术在临床的优化应用提供新的科学指导。

卵母细胞浆内单精子注射(ICSI)是一种有效的治疗不孕症的方法。然而，仍有1-3%的ICSI受精失败发生。卵母细胞激活不足(AOD)是ICSI失败的相关因素之一。人工卵母细胞辅助激活(AOA)的方法被认为是在这种受精失败的情况下是有用的。尽管AOA在许多辅助生殖中心是一个常规的过程，但迄今为止，还没有相关研究阐明AOA是否会通过干扰胚胎发育阶段的后续基因表达而增加发育风险。本项目研究中利用小鼠模型，提供了ICSI+AOA处理组与ICSI对照组来源的小鼠囊胚基因表达的整体模式的变化概况。本研究分为3组: (A, ICSI组)正常精子注射为对照组，(B, ICSI-AOA组)正常精子注射+AOA处理，(D, dICSI-AOA组)弱激活力精子注射+AOA处理。D组采用1μM和2.5μM离子霉素激活卵母细胞，与A组比较，通过钙振荡模式分析选择合适的AOA条件。钙振荡实验表明，2.5μM离子霉素可以使弱激活力精子产生正常的Ca2+反应活性。之后分别采集体外发育到囊胚期的胚胎进行转录组高通量测序。结果表明，ICSI-AOA组与ICSI组之间有133个差异表达基因，dICSI-AOA组与ICSI组之间有266个差异表达基因。同时，确定了上调和下调转录本的前10个Gene Ontology (GO)条目and 前 3个 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) 通路。本项研究中，我们将重点关注印记基因表达的变化。ICSI-AOA组和dICSI-AOA组印迹基因Igf2r均较ICSI对照组上调。对印迹基因Igf2r启动子(差异甲基化区域1，DMR1)的甲基化谱进行了分析，结果表明AOA处理不会影响DMR1的DNA甲基化。Igf2r/Airn印迹表达模型表明，AOA处理刺激母系等位基因特异性甲基化在DMR2扩散，随后启动父系Airn转录，进而调控 Igf2r的表达。尽管AOA越来越多地应用于人类辅助生殖，但它不应被认为是一种既定的治疗方法，必须谨慎使用。希望这些研究能够为辅助生殖生物学的研究提供有价值的见解和进展，并使本报告所揭示的基因和途径得到未来更多的研究。