辅助生殖工程来源的人胚胎干细胞传代培养过程中基因组变异及其对诱导分化的影响

The stability of the genome in human embryonic stem cells (hESCs) directly affect the safety of clinical applications .Our research group analyse the researches on assisted reproductive engieering based hESCs in the past eight years, combined with the latest research progress，and are going to give a further analysis on variations of CNVs and exome sequencing of hESCs genome during long-term culture from a new perspective，exploring the influence of variations on biological character and induced differentiation and uncover the molecular mechanism of variations further. We will detect single nucleotide polymorphisms(SNPs) and copy number variationss (CNVs) in genome of hESCs , adipose derived stem cells and neural stem cell from different passages by using SNPs microarray(humanOmniZhongHua-9 Chip) and human exome sequencing technology. Analyzing variations of CNV and exome sequencing by bioinformatic methods. Verifing the function of the corrresponding mutant gene by RT-PCR, westernblot and immunofluorescence. To clear whether the variations of the CNVs is accompanied with variations of the exome sequencing during the long-term culture, and whether these variations influence the differentiation efficiency in vitro culture,the biological function of the differentiated cells and the survival rate,migration rate and differentiation of transplanted cells in vivo? We are going to provide the safety proof of the experimental and theoretical basis for the clinical application of hESCs in the genetic characteristics.

人胚胎干细胞系（hESCs）基因组变异直接影响临床应用的安全性。项目组通过近8年对辅助生殖工程来源的hESCs的研究、结合最新研究进展，拟从新的角度深入分析传代培养过程中hESCs的基因组拷贝数变异（CNVs）和外显子组序列的变化，探讨变异对hESCs全能性和诱导分化的影响。拟采用HumanOmniZhongHua-8单核苷酸多态性（SNPs）芯片和人外显子组测序技术检测不同传代数的hESCs、诱导分化的脂肪干细胞和神经干细胞基因组SNPs和CNVs；利用生物信息学方法分析CNVs和外显子序列变化，用RT-PCR、免疫印迹和免疫荧光进行变异相关基因的功能验证。回答传代培养过程中的基因组CNVs是否同时存在外显子序列信息的变异，以及这些变异是否对体外诱导分化效率、分化后细胞的生物学功能以及体内移植细胞存活、迁移和分化产生影响？为hESCs的临床应用提供遗传安全性的实验和理论基础。

人胚胎干细胞（hESCs）是唯一可分化为含生殖细胞在内所有体细胞的干细胞。目前已成功将ES细胞诱导分化出几乎所有3个胚层的细胞类型，被认为是再生医学最重要的种子细胞之一，诱导分化后细胞移植的安全性目前亟待解决。长期传代培养基因组变异为将来临床应用带来巨大的风险。本研究目的为hESCs的临床应用提供遗传安全性的实验和理论基础。项目组采用Human Omni ZhongHua-8单核苷酸多态性（SNPs）芯片和人外显子组测序技术检测不同传代数的hESCs、诱导分化细胞基因组的SNPs和CNVs；进而利用生物信息学方法处理数据、分析CNVs和外显子序列变化，用RT-PCR、免疫印迹和免疫荧光进行变异相关基因的功能验证SNP芯片可用于hESC系分子细胞遗传学分析，并能提供与已知250种疾病相关的“身份鉴定”。另外研究结果提示长期传代培养过程中hESCs 存在SNP、CNV 和LOH 的动态变化，在早期传代过程中hESCs 能够保持基因组稳定性，随着传代次数的增加，基因组的不稳定性也逐渐增强。hESCs 长期培养过程中晚期代数的细胞中高甲基化位点增多。分析遗传变异相关基因的通路，有助于理解变异基因的生物学功能。诱导分化过程中的CNV可以由hESCs继承而来，虽然CNV相关基因不变，但长度会发生微小变化，早期代数会略有增加，而晚期代数呈现动态变化。神经诱导分化过程也会产生新的CNV，晚期代数的细胞出现适应性生长。不仅需要严密监测传代培养的hESCs，也要监测相应传代数hESCs 诱导分化的细胞，明晰细胞的遗传特征，保证移植细胞的遗传安全性。