L1介导的逆转座在海马成体神经发生中的作用机制研究

L1 retrotransposition function as major players in genome evolution and regulation, contributing to genomic variability and functional diversity between individual neurons of the brain. A large piece of evidence based on in vitro overexpression and transgenic mouse model has shown that L1 retrotransposition generates somatic mosaicism in neuronal progenitor cells and neurons, but how the endogenous L1-mediated retrotransposition events impact neurogenesis remains nebulous. L1 are such abundant retrotransposons as the establishment of loss-of-function mouse models by conventional gene knock-out or RNAi-mediated knock-down techniques were frustrated. In the current project, we are going to create novel L1 defective mouse model using CRISPRi, which has been successfully used to silence multiplex gene in the mouse brain in our previous study. We propose to apply this model to further investigate the underlying biology of endogenous L1-mediated retrotransposition events during adult hippocampal neurogenesis, from molecules, cells, and brain to behavior. Our goal is not only to provide insight into L1, the genomic dark matter; but also to understand the mechanisms and functional implications of adult hippocampal neurogenesis, inspiring a new way of treatment in neurodevelopmental disorders.

逆转录转座子L1是介导基因组进化的主要动力之一，进而造就了大脑中神经元及其功能的多样化。尽管基于体外过表达细胞和转基因小鼠模型的研究表明L1介导的逆转座事件能影响神经祖细胞的命运决定，但是内源性L1在体内调控神经发生的模式和生理功能仍旧十分不明晰。这主要是由于L1在基因组具有多重拷贝的缘故，难以通过常规的基因敲除或者RNAi干扰方法建立L1功能缺陷的小鼠模型，因而极大的限制了在体研究内源性L1的生物学功能。本研究拟以拥有多重基因靶向特异性的CRISPRi基因沉默技术构建L1条件型敲低的小鼠模型，解析在海马成体神经发生过程中内源性L1介导的逆转座事件，即从分子、细胞、脑、行为多尺度的调控作用。本研究不仅有助于加深对基因组“暗物质”L1基因逆转座功能的洞见，而且有助于理解成体神经发生重塑大脑功能的生物学过程，为神经发育相关疾病的研究提供新思路。

逆转录转座子L1是介导基因组进化的主要动力之一，进而造就了大脑中神经元及其功能的多样化。尽管基于体外过表达细胞和转基因小鼠模型的研究表明L1介导的逆转座事件能影响神经祖细胞的命运决定，但是内源性L1在体内调控神经发生的模式和生理功能仍旧十分不明晰。本项目利用CRISPR技术建立了L1的小鼠海马成体神经发生模型，在细胞、脑及行为等层次在体研究了L1对神经元发育以及动物行为的影响。免疫荧光分析结果表明L1在海马CA1、齿状回颗粒细胞层和皮层神经元中均存在表达活性。鉴于L1种类繁多和多重拷贝的特性，我们充分借助CRISPR多重靶向的特性设计了多个串联L1sgRNA表达，结果显示我们可以抑制大约50%的L1ORF1p蛋白质表达，且该模型可以用于研究海马神经元发育事件。免疫荧光分析发现L1缺失有助于神经干细胞向其中间前体细胞和未成熟神经元状态转变，但是不改变其最终成熟状态的稳态。动物行为学研究结果表明海马齿状回神经元L1缺陷并不改变小鼠的运动能力和空间依赖性学习行为，但是会促进其探索新异环境的识别记忆能力。本研究揭示了L1在海马神经元早期发育过程中的重要作用，有助于理解成体神经发生重塑大脑功能的生物学过程，同时为基因组暗物质的功能研究提供了概念案例。