白菜花粉发育相关MYB转录因子受miR319调控通路的研究

On the basis of discovering a MYB transcription factor BcMYB81/104, which is related to pollen development in Brassica campestris ssp. chinensis, and its potential upstream regulator bra-miR319, we plan to analyze the temporal and spatial expression patterns of BcMYB81/104, and then use the CRISPR-Cas9 and transgenic technology to analyze its biological functions during the processes of pollen development. Over-expression, GFP and GUS fusion expression systems will be used to unveil the regulation of BcMYB81/104 by bra-miR319. Combining with the research findings existed previously, the similarities and differences between the regulations of MYB by miR319 and/or miR159 will be analyzed. Meanwhile, ChIP and EMSA assays will be chosen to screen and verify the putative downstream target genes of BcMYB81/104, then more researches will be conducted to analyze the function of these genes. By building the regulatory network of “microRNA-MYB-MYB target genes”, we can gain further understanding of the complicated regulations of MYB in pollen development from the perspective of interactions between microRNA and MYB, MYB and its target genes. What’s more，these results will lay a considerable theoretical foundation for the effective fertility control in important crops especially in vegetable crops.

本项目在发现白菜花粉发育相关MYB转录因子编码基因BcMYB81/104及其上游调控因子bra-miR319的基础上，拟利用CRISPR-Cas9基因敲除和转基因等技术，结合亚细胞定位和时空表达模式分析，研究BcMYB81/104的功能；采用过表达、GFP瞬时表达及GUS融合表达体系，研究bra-miR319调控BcMYB81/104的机制，并结合已有研究，比较miR319与miR159对MYB调控的异同；通过染色质免疫共沉淀测序和凝胶电泳迁移实验筛选并验证BcMYB81/104下游靶基因，并对下游靶基因进行功能分析，从而构建“microRNA–MYB转录因子–下游靶基因”在花粉发育过程中的调控网络。这些研究将为有效控制蔬菜等农作物育性提供理论依据。

前期研究发现白菜miR319有可能参与调控BcMYB81/104（即BcMF28）而影响花粉发育，而miR159与miR319家族相似性较高，且有相同的预测靶基因，那么，miR319与miR159如何参与BcMYB81/104调控，以及它们之间有哪些异同，是白菜等十字花科作物等值得深入研究的问题。.本项目采用qRT-PCR、启动子融合表达等技术分析了BcMF28的时空表达模式，发现其在花序中特异表达；利用amiRNA技术和转基因等技术，研究了BcMF28的功能，发现其对于花粉外壁网纹结构的正常形成，外壁孔隙内含油层的分布发挥作用；采用qRT-PCR和启动子融合表达技术分析了bra-miR319和Bra-miR159的时空表达模式，发现bra-miR319和Bra-miR159的表达存在差异；利用5’ RACE技术、烟草瞬时表达体系，研究了Bra-miR319和Bra-miR159对BcMF28的调控，发现在白菜中只有Bra-miR319参与其调控，Bra-MIR319a和Bra-MIR319b能抑制BcMF28的表达，而Bra-MIR319c不能对BcMF28进行调控；构建并获得白菜bra-miR159和 bra-miR319过表达植株，发现bra-miR159和 bra-miR319都在花粉发育中起作用，但是他们导致花粉败育的时期存在差异，此外，白菜MIR319a、MIR319b、MIR319c异源表达拟南芥还能引起拟南芥叶片、花瓣褶皱；利用qRT-PCR方法，筛选得到BcMF28调控的下游靶基因，发现其可能涉及苯丙烷类代谢途径的调控；同时，利用qRT-PCR方法和启动子融合表达技术分析了与BcMF28一样，同属于MYB转录因子的DUO1的潜在靶基因BrDAZ3的时空表达情况，发现其在成熟花粉时期高表达，且在授粉受精过程中持续表达。本项目初步明确了“microRNA–MYB转录因子–下游靶基因”在花粉发育过程中的调控路径。这些研究将为有效控制蔬菜等农作物育性提供理论依据。