白菜花粉发育相关PME及其互作PMEI基因的表达与功能研究

On the basis of known 24 pectin methylesterase (PME) genes and 15 PME inhibitor (PMEI) genes specifically expressed in the pollen of Chinese cabbage (Brassica campestris ssp. chinensis), we plan to perform yeast two hybridization and related experiments to find out the PMEI that interacted with PME. By using TELEN targeting or amiRNA methods, we suppose to investigate the changes of PME expression and activity after PMEI gene silencing or over-expressing, and thus to determine whether different types of PME interact with different PMEIs and how they interact with each other. Then select representative PME and PMEI and get gene suppressed and over-expressed transgenic plants. By testing the changes in structure of cell wall polysaccharides of pollen and pollen tube via chromatography-mass spectrometry technology, and methyl esterification degree changes of pectin via JIM5 and JIM7 antibodies labeling, we presume to analyze the influence of selected genes on the cell wall structure and identify the genes' function and their regulation relationship in the process of pollen development, pollen germination and pollen tube growth. These studies will not only deepen our comprehension of the role of PME and PMEI gene family in pollen development and pectin metabolism in the process of pollen cell wall formation and pollen tube growth, but also provide us powerful theoretical basis of the molecular mechanism of pollen development and its related process and effective control measures of the sterility of vegetable and other crops.

本项目以发现的白菜花粉特异24个PME基因和15个PMEI基因为基础，利用酵母双杂交等技术，找出与PME存在互作关系的PMEI；通过TELEN打靶或amiRNA等方法，分析目的PMEI基因的表达变化对相关PME基因的表达及酶活的影响，探明不同类型的PME与PMEI是否存在以及存在怎样的对应关系；进而选取代表性的PME和PMEI获得表达抑制和过表达转基因植株，采用气相色谱-质谱联用技术测定转基因植株花粉壁和花粉管壁中多糖成分的变化，利用JIM5、JIM7抗体标记不同甲酯化程度的果胶，分析目的基因对细胞壁结构的影响，明确其在花粉发育及花粉萌发、花粉管生长等生殖发育过程中的生物学功能和调控机制。这些研究不仅有助于从整体上认识PME及PMEI基因家族在花粉发育中的作用，加深对花粉壁形成及花粉管生长等过程的果胶代谢的理解，也为全面认识花粉发育及其相关过程的分子机理，有效控制蔬菜等农作物育性提供依据。

果胶甲酯酶（pectin methylesterases, PMEs）是一类重要的细胞壁水解酶，与花粉发育和花粉管形成密切相关，在植物有性生殖过程中发挥重要作用。PME活性受果胶甲酯酶抑制子（pectin methylesterase inhibitors, PMEIs）的调控，二者共同影响细胞壁中果胶的甲酯化水平。PME和PMEI家族都是大的基因家族。在进化过程中，由于全基因组复制和串联复制事件的发生，会产生许多重复PME和PMEI基因。此外，全基因组复制事件后通常伴随着会引起大量基因丢失的二倍化事件，导致重复PMEI基因命运的改变。前人已对多个物种的PME和PMEI基因家族成员的进化机制和表达特征进行了一定程度的分析。然而，PME和PMEI基因家族成员在进化过程中的扩张模式，重复PME和PMEI基因的表达特征，以及同源PME和PMEI基因的比较和功能鉴定等方面尚不甚明了。本项目利用生物信息学的手段，结合qRT-PCR、亚细胞定位和启动子融合表达分析，通过对白菜等九个物种中的PME基因家族成员以及其中的花发育相关PME基因的鉴定和表达分析，以及对白菜和甘蓝PMEI基因家族成员的基因结构、理化性质、保留率、共线性关系、进化速率、启动子元件和表达模式的深入研究，揭示了白菜PME和PMEI基因家族成员的进化模式、表达特征和可能的功能分化。同时，结合白菜PME和PMEI基因家族成员的分析结果和转录组数据，重点针对白菜花粉发育相关的PME基因BcMF23a和BcMF27，以及PMEI基因BcPMEI1和BcPMEI85，通过亚细胞定位、时空表达分析、组织原位杂交、启动子融合表达和过表达、反义RNA、人工microRNA技术，以及对转基因植株的形态学、细胞学、遗传学水平的观测分析，阐明了这些基因的表达模式和生物学功能。此外，本项目率先建立了白菜的CRISPR/Cas9基因编辑体系，并采用此技术成功实现了对白菜花粉发育相关PME基因BcPME37c的编辑，继而鉴定了其功能，这项创新为白菜基因功能鉴定和重要功能基因的挖掘和利用提供重要的技术支撑。