转录因子MYB80相关的lncRNA在白菜花粉外壁发育中的功能及作用机制研究

The formation of the outer pollen exine is essential for the protection of the male gametophyte and plant reproduction. MYB80, a R2R3-type MYB transcription factor, is required for exine formation, and systems involving manipulation of MYB80 function have been developed for the production of F1 hybrid seeds. However, the regulation of the expression of MYB80 is unknown yet. Taking the advantage of transcriptome sequence, three lncRNAs co-expressed with BrMYB80 are found at the regions of BrMYB80 in Brassica rapa. In this program, we try to explain the biology functions, molecular mechanisms and the relationships to BrMYB80 of these three lncRNAs through observing the phenotypes of the expression defected and over-expression lncRNA plants, defining the down-stream genes and the regulation for them on the expression of mRNA and proteins of BrMYB80 by RNA-seq and Western-blot, detecting the interactions between the lncRNAs and DNA, RNA sequences, so do proteins through ChIRP, RNA pull-down and RNase protection assays. These researches will do a great favor on understanding the MYB80 regulation pathway in exine formation, get us to know more about the function of lncRNA played in pollen development and as well as the mechanism underline the male sterility.

花粉外壁的形成是花粉发育的重要组成部分，对植物繁殖至关重要，作为该过程的核心调控因子，MYB80已被用于构建雄性不育系应用于作物杂交育种，但其上游调控通路仍不清楚。本项目以位于BrMYB80基因区域并与之一样在白菜四分体时期花药特异表达的三个lncRNA为研究对象，通过观察它们表达抑制和过表达转基因植株表型并与BrMYB80相应转基因植株表型作对比，分析它们对下游基因及BrMYB80表达的影响，进而利用RNA纯化的染色质分离、RNA酶保护实验等方法鉴定它们是与DNA、RNA还是蛋白质结合起作用，以此获知它们在花粉外壁发育中的生物学功能、作用机制以及在BrMYB80表达调控中的作用。为梳理MYB80调控通路及花粉外壁发育的分子机理，也为解析lncRNA在花粉发育中的作用，最终充分认识花粉发育基因表达调控网络，推进对作物雄性不育机制的理解及重要功能基因的利用提供理论基础。

花粉外壁的形成是花粉发育的重要组成部分，对植物繁殖至关重要，其形成始于四分体时期，MYB80是其中一个核心调控因子，但MYB80本身的表达调控及其所参与的花粉壁调控机制尚不清楚。本项目以位于白菜BrMYB80基因区域的4个长链非编码RNA（lncRNA）和位于拟南芥AtMYB80区域的1个lncRNA为研究对象，通过构建表达抑制或过表达转基因植株研究它们在花粉外壁发育中的生物学功能、作用机制以及在BrMYB80表达调控中的作用，同时，进一步分析了白菜‘矮脚黄’核不育花粉壁缺陷的原因并构建了花粉壁基因表达调控网络。取得如下主要结果：（1）获得BrMYB80基因座区域4个lncRNA以及AtMYB80基因区域1个lncRNA的全长序列，并发现lncRNA存在不同的转录本形式，明确它们为非编码RNA并在花粉发育的四分体时期优势表达的特点，其中某些lncRNA的表达可能受DNA甲基化机制调控。（2）通过转基因方式明确了上述5个lncRNA在花粉外壁发育中的功能，其中，位于MYB80反义链上的反义lncRNA在白菜和拟南芥中的功能保守，其过表达造成花粉外壁基粒棒缩短或消失以及顶盖层部分缺失，它们通过负调控MYB80的表达而参与花粉外壁的构建；位于BrMYB80a启动子区域的正义lncRNA的过表达导致花粉萌发沟异常即花粉外壁堆积模式的异常，而表达抑制造成花粉外壁外层的过度堆积，其对MYB80存在负调控作用；位于BrMYB80b正义链上的lncRNA的过表达同样造成花粉萌发沟的异常，但其在拟南芥中的异源表达并未造成异常，说明其是白菜特异的。（3）明确白菜‘矮脚黄’核不育两用系花粉壁发育的异常始于绒毡层PCD和胞质分裂胼胝质降解异常，通过对花粉发育不同时期进行RNA测序，鉴定到一批花粉壁发育相关基因，并构建了花粉壁发育的基因调控网络。这些研究结果为梳理MYB80为核心的花粉调控通路及花粉外壁发育的分子机理，最终充分认识花粉发育基因表达调控网络，推进对作物雄性不育机制的理解及重要功能基因的利用奠定了理论基础。