甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的精细定位与克隆

白粉病是甜瓜（Cucumis melo L.）生产中重要病害之一。由于白粉病菌存在多个种及繁多的生理小种，且抗性遗传机制复杂，采用传统育种技术聚合多个抗病基因困难较大，开展甜瓜抗白粉病基因精细定位与克隆研究，将为甜瓜抗白粉病分子育种及抗性机理研究奠定坚实的基础。本项目利用已构建的高抗白粉病菌优势小种P.xanthii 2F为亲本材料的重组自交系（RILs）群体(F2S6代)为试材，将抗性基因Pm-2F定位在基因组2.2cM区域，依托最新的黄瓜全基因组测序信息以及国际葫芦科基因组计划获得的甜瓜EST数据库，在F2大群体（2600株）上开展抗病基因Pm-2F的精细定位与候选基因预测，并获得候选基因，然后对120份抗-感白粉病品种进行候选基因全长序列的关联分析，以确定目标基因，最后利用RNAi技术对目标基因沉默，开展基因功能验证，最终实现甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的克隆与功能验证。

本研究以高抗白粉病的K7-1和感病品种K7-2构建的RILs群体106株系为材料，利用BSA法结合SSR技术，将Pm-2F基因定位于两侧翼标记SSR02734和CMBR8之间2.2 cM范围内，完成了甜瓜抗白粉基因Pm-2F的初步定位。根据Pm-2F基因初步定位区段内序列信息，开发了新的CAPS标记和InDel标记，对2200个F2群体单株进行标记分析，将Pm-2F基因定位于标记Indel02和CAPS-DdeⅠ之间0.47 cM的范围内，生物信息学分析表明，Pm-2F基因精细定位区域的物理距离仅为8 kb，基因注释发现该区域仅存在1个NBS-LRR类R基因，但该基因存在部分缺失。为了进一步克隆目标基因，构建了甜瓜抗性亲本K7-1的BAC文库，利用与Pm-2F基因紧密连锁分子标记，PCR法筛选出了含Pm-2F候选基因的阳性BAC克隆。对阳性BAC克隆进行鸟枪法测序，对获得序列进行基因预测，最终确定并成功克隆得到Pm-2F的候选基因。研究构建了Pm-2F基因的过表达和RNAi载体，并利用农杆菌介导的转化方法获得了部分转基因植株，以上结果不仅为甜瓜抗白粉病分子聚合育种提供了技术支撑，也为进一步开展候选基因的功能分析，进而揭示甜瓜抗白粉病的分子机制奠定了基础。