莱茵衣藻高荧光突变体CrF6的基因克隆与功能分析

xygenic photosynthesis that occurs in cyanobacteria and green algae and plants is essential for aerobic organisms on Earth. The light-driven reactions of photosynthesis are carried out by multi-subunits pigment-protein complexes located in thylakoids, i.e. PSI, PSII, Cytb6f and ATP Synthase. Photosystem II (PSII) performs one of the key reactions: the light-driven oxidation of water. This fundamental but very complex process requires PSII to act in a highly coordinated fashion. Though the knowledge of composition and structure of PSII have been updated greatly, our understanding on molecular regulation mechanisms is still limited. To gain more information on this, we isolated and characterized a mutant CrF6 of Chlamydomonas reinhardtii，which shows higher chlorophyll fluorescence and is severely deficient in the accumulation of PSII supercomplexes compared with the wild type. The goal of this research is elucidation of the molecular mechanism for the biogenesis and regulation of photosystem II. Firstly, the mutated gene will be isolated, expressed as recombinant protein followed by antibody production. Location of CrF6 protein will then be determined by immuno-detection. Secondly, structural analysis and function prediction of this new gene/protein will be executed by bioinformatics methods. Thirdly, an in-depth analysis of the function of CrF6 in PSII will be investigated using Northern blot, BN/PAGE, sucrose density gradient centrifugation, etc. Experimental findings will bring about new genes and new functions involved in regulation of light conversion in the organism.

光合作用的高效能量转换机制，是生命科学领域研究的核心科学问题之一。过去的研究在很大程度上加深了人们对光能转换主要过程、光合膜蛋白复合体组成及结构的认识，但对光合膜蛋白复合体生物发生与动态调节的分子调控机制的了解还很有限, 需要展开更加深入的研究。我们获得了一个莱茵衣藻高叶绿素荧光突变体CrF6，通过分析光合表型确认突变体的PSII功能受到损伤，但其作用机制还不清楚。因此，本项目拟以突变体CrF6为材料，克隆目的基因，进行结构分析和功能预测。比较突变体与野生型在PSII亚基转录/翻译水平、合成/周转速率以及PSII稳定性等方面的差异，并鉴定CrF6的互作蛋白，分析CrF6对PSII形成和积累的影响及其作用方式。从而发现CrF6与PSII结构与功能的关系，揭示其在衣藻光合作用中的生物学功能。研究成果不仅有助于加深人们对光合作用调控机理的认识，对发掘高光效新基因、培育高光效藻种也有重要意义。

PSⅡ是光合作用的核心，它在光的驱动下催化水和质体醌的氧化还原，通过原初电荷分离产生电子并将其传递到光合电子传递链。PSⅡ的结构在光合生物中高度保守，它是由20多个蛋白质亚基及大量辅因子组成的超级复合体。大量研究证明PSⅡ的组装与修复都是保守、高度有序、按一定步骤发生的复杂生物过程，需要许多辅助因子在特定步骤进行精细的调控。Psb28在所有光合生物中都存在同源蛋白，在蓝藻6803中可能参与CP47、PsaA/PsaB的生物合成和PSⅡ的修复，具体作用机制目前仍不清楚，PSB28在绿藻和高等植物中的功能及作用机制目前仍未见报道。本项目在获得了一批潜在的莱茵衣藻光合作用突变体基础上，通过TAIL-PCR鉴定得到一个psb28基因缺失的衣藻突变体，并对该突变体从分子生物学和生理生化等方面进行了分析，对莱茵衣藻PSB28蛋白的功能进行了详细的阐述。研究结果表明：1) 衣藻PSB28蛋白的缺失导致叶绿素荧光参数Fv/Fm、Y(Ⅱ)显著降低，衣藻的光合自养和混养生长速率变慢，但细胞内叶绿素的含量没有变化。2) 突变体的PSⅡ活性显著降低，突变体PSⅡ反应中心的亚基含量也显著下降。3) Psb28蛋白除了以未组装的形式存在，还有一部分位于PSⅡ的单体和RC47中，而且该蛋白的缺失导致PSⅡ超级复合物的含量下降，而游离的PSⅡ反应中心亚基尤其是CP43的含量显著积累。突变体D1蛋白的合成速率下降，周转速率延缓，并发现PSB28蛋白与D1蛋白存在相互作用，因此表明PSB28可能通过与D1相互作用来调控它的合成，从而稳定RC47组装中间复合物。4）突变体对高光处理更加敏感，PSⅡ的修复过程严重受阻。综合以上研究结果，我们认为衣藻PSB28蛋白参与PSⅡ的组装与修复过程，其作用机制是通过影响D1蛋白的合成来实现的。本项目为进一步认识PSⅡ的组装和修复过程提供了新的知识。