土曲霉LYT10中衣康酸降解途径的鉴定及其生理意义研究

Aspergillus terreus LYT10 is an industrial production strain and has been applied to mass production of itaconic acid. Our previous studies proved that A. terreus LYT10 possesses the ability of degrading itaconic acid during the synthesizing process. And the balance between the synthesis and degradation pathway was assumed to be regulated by the exogenous added itaconic acid. The researches improving itaconic acid by genetic engineering were almost aimed at biosynthesis pathway of itaconic acid rather than degradation pathway. In this study, we will identify the degradation pathway of itaconic acid in A. terreus LYT10, and analyze the influence of blocking of the degradation pathway on the itaconic acid biosynthesis and other metabolic processes. Furthermore, we will try to explore the balance mechanism between the synthesis and degradation pathway of itaconic acid, which would offer a novel metabolic engineering strategy to promote the production of itaconic acid that focussing on the degradation pathway.

土曲霉LYT10是一株衣康酸工业生产菌株，已用于衣康酸的大规模工业生产。土曲霉LYT10在合成衣康酸的同时还具有降解衣康酸的能力，且衣康酸的合成与降解之间的平衡可能是受“外源”衣康酸浓度的调控。目前关于通过基因工程改造来提高土曲霉衣康酸产量的研究，都是针对衣康酸的生物合成途径，而很少有人关注衣康酸的降解途径，目前也并未有关于土曲霉中衣康酸降解途径的报道。本项目将对土曲霉LYT10的衣康酸降解途径进行鉴定；通过降解途径的阻断来研究衣康酸降解途径对于衣康酸合成及其它细胞代谢活动的影响，探讨降解途径存在的生理意义；并初步探讨土曲霉中衣康酸合成与降解代谢的平衡机制，为针对衣康酸降解途径的遗传工程改造提供理论基础。

土曲霉LYT10是一株衣康酸工业生产菌株，已用于衣康酸的大规模工业生产。我们在进行土曲霉对高浓度衣康酸抗性实验中发现，土曲霉LYT10在合成衣康酸的同时还具有降解衣康酸的能力。而目前关于通过基因工程改造来提高土曲霉衣康酸产量的研究，都是针对衣康酸的生物合成途径，而很少有人关注衣康酸的降解途径。因此，这一发现也为土曲霉高产工程菌株的构建提供了一个全新的方向。.本项目鉴定了土曲霉LYT10衣康酸降解途径的3个关键酶：衣康酰-CoA转移酶AtIct、衣康酰-CoA水合酶AtIch和柠苹酰-CoA裂解酶AtCcl，并通过体外实验验证了这3个关键酶的催化反应机制，最终解析了土曲霉中的衣康酸降解途径：衣康酸首先被AtIct催化为衣康酰-CoA，同时衣康酰-CoA可能会转化为其同分异构体中康酰-CoA或柠康酰-CoA；接下来，衣康酰-CoA在AtIch作用下，加一分子水，生成柠苹酰-CoA；最后，柠苹酰-CoA在AtCcl作用下裂解为丙酮酸和乙酰-CoA。.为了探讨衣康酸降解对土曲霉衣康酸产量的影响，在土曲霉高效同源重组菌株Δku80基础上构建了衣康酸降解途径突变菌株，并测定了降解途径的阻断对衣康酸合成途径基因表达和衣康酸产量的影响。与出发菌株相比，衣康酸降解关键基因敲除后，突变株的胞内粗酶液对衣康酸的降解能力有所缓解，但是衣康酸的降解未完全阻断，推测土曲霉中还有其他降解途径或降解基因存在。正常发酵条件下，突变株ΔAtccl的衣康酸产量提高了7.1%、发酵周期缩短约6 h。研究表明，通过阻断衣康酸降解途径来增加衣康酸的积累是可行的，但若想进一步提高衣康酸的积累仍然需要对其他降解途径和基因进行全面解析。