拟南芥Flot1蛋白参与介导的囊泡转运的调控研究

Endocytosis is an essential process by which eukaryotic cells internalize exogenous and plasma membrane material, and it is required for growth and developmental processes in organisms. However, the molecular machinery underlying the endocytosis and vesicle trafficking is largely unknown. Especially studies on the regulation mechanism of clathrin-independent endocytosis and vesicle trafficking in living plant cells remain quite limited. Based on our previous investigations, we will explore the mechanisms of memebrane microdomain and cytoskeleton acting on Flot1-positive vesicle trafficking in Arabidopsis. First, we will analyze the trafficking pathway of Flot1-positive vesicle. Then, we will elucidate the roles of membrane microdomain in the endocytosis of Flot1-positive vesicle. Finally, we will further explore the cytoskeleton in regulating Flot1-positive vesicle trafficking. In the course of the investigation, some new methods and techniques including variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy, fluorescence correlation spectroscopy and fluorescence cross-correlation spectroscopy will be used to determine the regulation mechanisms of Flot1-positive vesicle trafficking. Surely, the results of this study will lay foundation for the regulation mechanisms of vesicle trafficking in living plant cells.

内吞作用是将胞外物质或环境信号传递到胞内的重要生命过程，对维持机体的生长和发育起着重要作用。然而，植物囊泡转运的分子机制尚不十分明确，特别是膜筏微区介导的不依赖于笼形蛋白的囊泡，其内吞和转运的调控机理研究仍比较稀少。本项目拟在前期工作的基础上，以模式植物拟南芥为实验体系，着重开展以下三方面的研究：（1）研究拟南芥Flot1蛋白参与介导的囊泡内吞和转运途径；（2）解析膜微区对Flot1蛋白参与介导的囊泡内吞的调控机制；（3）探讨细胞骨架对Flot1蛋白参与介导的囊泡转运的调控机理。在该研究拟采用可变角度的全内反射荧光显微术、荧光相关光谱和荧光互相关光谱等新技术，旨在系统阐明Flot1蛋白参与介导的囊泡内吞和转运的调控机制，为进一步揭示植物细胞囊泡转运的分子机理提供依据。

膜筏（membrane rafts）是细胞质膜上富含固醇类和鞘脂类的微结构域，大小10-200 nm，是一种高度动态的异质性结构，在细菌和病毒感染中具有十分重要的作用。然而，植物胞内转运的分子机制尚不十分明确，特别是膜筏微区参与介导的不依赖于网格蛋白的囊泡，其胞吞和转运的调控研究仍比较稀少。本项目以拟南芥 (Arabidopsis thaliana L.) 为研究材料，利用分子生物学和细胞生物学的方法，对拟南芥膜筏微区标记蛋白Flot1在病原分子刺激前后的胞吞作用和囊泡转运过程进行了研究，并对该蛋白的最终命运进行了探讨。我们运用可变角度的全内反射荧光显微术 (variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy, VA-TIRFM)和荧光相关光谱 (fluorescence cross spectroscopy, FCS)观察拟南芥幼苗表皮细胞上的GFP-Flot1分子，研究发现flg22刺激后，Flot1蛋白的运动范围增加，Flot1蛋白在细胞质膜上的密度减小。此外，我们发现Flot1在拟南芥叶表皮细胞中有组成型胞吞现象，而且flg22能够促进其胞吞作用。最为重要的是，flg22处理使得Flot1更多地进入到晚期内涵体，进而进入液泡降解。并且免疫印迹结果显示，flg22的刺激使得Flot1的降解程度随时间的增加而增加，说明Flot1蛋白参与了细胞对病原分子的防御反应。本研究旨在系统阐明Flot1蛋白参与介导的囊泡胞吞和转运的调控机制，为进一步揭示植物细胞囊泡转运的分子机理提供依据。