中华绒螯蟹卵母细胞最后(生理)成熟分子机制的研究

许多动物卵母细胞最后生理成熟受促性腺激素调控，生发泡的破裂是卵母细胞达到最后成熟的标志，成熟促进因子（MPF）是卵母细胞成熟最关键的细胞因子，MPF的激活需要促性腺激素的诱导。为了解明中华绒螯蟹卵母细胞最后成熟机制，我们研究组之前首先克隆了MPF中的cyclinB 和Cdc2激酶全长cDNA, cyclinB转录本表达量与卵母细胞成熟紧密相关，同时发现cyclinB mRNA3'非编码区存在多个不同种miRNA结合位点，暗示cyclinB 基因的表达可能受miRNA调控。本研究拟分离鉴定目的miRNA，进一步验证miRNA是否对cyclinB的表达具有调控作用；通过体内注射促性腺激素和卵母细胞体外共培养方法，探究激素对miRNA、cyclinB、Cdc2表达的影响，查明激素、miRNA和MPF三者之间的关系，以便最终全面阐明中华绒螯蟹卵母细胞最后生理成熟的生理生化分子机制。

许多动物卵母细胞最后生理成熟受促性腺激素调控，生发泡的破裂(GVBD)是卵母细胞达到最后成熟的标志，成熟促进因子（MPF）是卵母细胞成熟最关键的细胞因子，MPF的激活需要促性腺激素的诱导。然而，相应的激素系统在虾蟹类尚未很好地建立起来。为了解明中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)卵母细胞最后成熟机制，本研究首先应用反向HPLC分离了中华绒螯蟹脑组织促性腺激素释放激素（GnRH）类似物，串联质谱分析表明，该GnRH类似物具有两个亚型（EsGnRH-Ⅰ和EsGnRH-Ⅱ），均为十一肽，其氨基酸序列具有GnRH家族相同保守位点。活体注射人工合成EsGnRH-Ⅰ和EsGnRH-Ⅱ能够促进卵母细胞生发泡破裂成熟，诱导卵母细胞成熟(GVBD)。为了解明GnRH对卵母细胞最后成熟调控的分子机制，我们克隆了MPF中的cyclinB 和Cdc2激酶全长cDNA,制备了多抗，免疫检测表明，在卵黄发生前期，cyclinB与Cdc2蛋白都定位在细胞质中，卵黄发生期都从细胞质转移到细胞核中，在卵母细胞成熟时cyclin B和Cdc2蛋白量显著增加，Cdc2激酶活性也显著性增加，生发泡破裂后cyclin B和Cdc2蛋白都聚集在纺锤体上，说明MPF在生发泡破裂、纺锤体形成等卵母细胞减数分裂成熟过程中起关键作用。荧光定量PCR分析表明，注射EsGnRH后，在GVBD期 cyclin B mRNA量并未显著性变化，但Western blot检测结果显示cyclin B蛋白量显著增加，与此同时，Cdc2激酶活性在GVBD期也显著性增加，说明GnRH可通过激活MPF调控卵母细胞成熟。.由于cyclinB mRNA3’非编码区存在多个不同种miRNA结合位点，暗示cyclinB 基因的表达还可能受miRNA调控。通过构建卵巢小分子RNA库和高通量测序，我们共得到191个unique miRNA（55个为已知miRNA），其中mir-2，mir-7，mir-79 5’端核心序列分别与miRNA结合位点完全互补，荧光定量分析表明mir-2表达量在卵母细胞成熟后显著性升高，将miR-2 mimics与含miRNA结合位点双荧光素酶报告基因载体共转染293T细胞，荧光素酶活性极显著性下降，表明mir-2可能参与负调控cyclin B蛋白的表达。