锌离子调节酵母菌乙醇耐性的分子机制和胁迫耐受酵母的构建

对一株自絮凝酵母菌株进行高浓度乙醇连续发酵实验时发现,培养基中锌离子的添加可提高酵母菌的乙醇耐受性和高温耐受性，促进胞内海藻糖和麦角固醇的合成，并降低胞内甘油的合成，提高乙醇产量和乙醇产率。针对这一实验现象，本课题计划考察高浓度乙醇连续发酵条件下，胞外锌离子浓度对酵母菌全局基因表达的影响，重点研究胁迫相关锌指蛋白基因随锌离子浓度不同表现出的基因表达差异，鉴明关键锌指蛋白基因，分析基因间的相互作用网络；分析丙酮酸代谢、甘油合成等途径关键代谢节点在不同锌离子浓度下的变化情况，揭示锌离子对酵母菌代谢的多效调节机制，以及其提高酵母菌乙醇耐受性和发酵效率的分子机理，并在此基础上寻找代谢工程靶标，进行酵母菌胁迫耐性的定向改造。预期取得的研究结果，不仅可以加深对锌离子调节酵母菌生理和代谢过程机理的认识，而且还可以构建对乙醇、高温以及其他胁迫因素耐受性提高的酵母菌株，提高燃料乙醇的发酵效率和生产经济性。

锌是细胞重要的微量元素营养成分，但锌对酿酒酵母细胞环境胁迫耐性的影响及分子机制研究还较少。本项目利用转录组学、蛋白组学分析及进一步的功能验证研究了锌提高酿酒酵母环境胁迫耐受性的分子机制，并在此基础上构建了环境胁迫耐性提高的酿酒酵母重组菌株，提高了乙醇发酵效率。在150 g/L葡萄糖浓度下连续发酵培养基中添加0.05 g/L的硫酸锌后，发酵稳态时对细胞进行致死浓度的乙醇冲击以及热击，发现加锌组细胞存活率上升。分析发酵液及菌体成分，发现加锌组发酵液中乙酸和丙酮酸等副产物水平下降，胞内ROS水平下降，N元素组成升高，麦角固醇含量上升等。稳态时取细胞做转录组与蛋白组分析，发现了锌添加对细胞有全局影响，共检测到330个转录差异基因和71个蛋白表达差异基因，涉及的代谢通路包括核糖体合成、糖代谢、脂类代谢、ROS响应及相关的氧化还原系统功能、细胞絮凝、金属离子内平衡、硫酸盐吸收和细胞壁合成等，并且能荷水平也可能有所改变。同时也发现转录组与蛋白组有大量的不一致现象，以及基因可变剪切的变化，表明锌的作用存在转录后与翻译后修饰。对个别可能的关键基因进行了功能分析，发现与蛋白降解相关的基因以及与组蛋白甲基化相关的基因过表达后，酿酒酵母细胞对酸和高温的胁迫耐性提高，另外与氧化胁迫相关及与金属转运相关的基因也证明与酿酒酵母环境胁迫耐性相关。本项目的研究成果为进一步提高酿酒酵母的发酵性能，以及深入理解锌对酿酒酵母代谢调控的影响奠定了良好基础。