高产代可可脂酿酒酵母菌株的构建及其分子机制解析

Cocoa butter extracted from cocoa beans is the main raw material for chocolate and other cocoa food production, but CB supply is insufficient due to the increased chocolate demand and limited cocoa butter production. Cocoa butter is mainly composed with 3 kinds of triacylglycerols which consist of fatty acids C16:0, C18:0 and C18:1. As a robust model species, Saccharomyces cerevisiae produces triacylglycerols as storage lipids which consist of C16:1 and C18:1 fatty acids, but cocoa butter equivalent (CBE) content is quite low. Our previous studies showed S. cerevisiae could be one potential CBE-producing chassis strain after metabolic engineering of its lipid biosynthetic pathway. Therefore, we try to engineer yeast to construct high-level CBE-producing strains and characterize the function of key genes in yeast CBE production: 1) Rational design and engineer yeast lipid biosynthetic pathway to produce high-level lipid-producing S. cerevisiae chassis strains and analyzing their metabolites; 2) Expressing, characterizing and screening efficient key genes in lipid biosynthetic pathway, such as desaturase gene, to construct efficient lipid biosynthetic pathway in S. cerevisiae for CBE production; 3) Dynamic control of gene expression level in yeast lipid biosynthetic pathway to produce balanced fatty acid precursor, intermediate and CBE, and try to reveal high-level CBE-producing mechanism. This study would not only help obtain high-level CBE-producing strains with efficient lipid biosynthetic pathway, but also give some design and construction clues and principles about production of specific functional lipid (such as cocoa butter) in yeast. Moreover, high-level CBE-producing yeast strains would provide an optional way for cocoa butter production.

可可脂提取自可可树的果实，是制作巧克力的主要原料，其产能有限但需求不断增加。可可脂主要含有由C16:0、C18:0和C18:1脂肪酸组成的甘油三酯。作为模式生物，酿酒酵母生产以C16和C18脂肪酸组成的甘油三酯作为储能物质，但代可可脂成分较低。申请者前期研究表明经改造后，酿酒酵母可能用于代可可脂的生产。本项目拟构建高产代可可脂的酿酒酵母菌株，同时研究酿酒酵母高产代可可脂的关键基因：1）合理设计改造酿酒酵母油脂代谢途径，构建油脂合成的优良底盘细胞；2）分析、表征和筛选高效的关键基因如去饱和酶基因，在酿酒酵母中建立高效油脂合成代谢途径；3）调控酿酒酵母甘油三酯合成途径中关键基因的表达水平，平衡优化前体、中间代谢物及产物的比例生产代可可脂，探究高产代可可脂的分子机制。该研究不但能获得含高效油脂合成途径的高产代可可脂菌株，还有望解析酿酒酵母高产代可可脂的分子机制，为可可脂短缺问题提供新的解决方案。

可可脂是生产巧克力和部分化妆品的原料，主要从热带植物可可树的果实中提取获得。近年来，可可脂需求增加；可可树种植面积有限，导致可可脂供应短缺、价格上涨。挖掘可可脂合成关键酶，运用合成生物学方法改造酿酒酵母菌株，解析可可脂高产机制，有望以葡萄糖等廉价碳源为底物合成代可可脂，从而解决可可脂原料有限、巧克力市场短缺的问题。.在前期表征可可树中相关脂类合成相关基因的基础上，我们对高含可可脂主要成分的非洲乳油木果实的脂类成分进行了分析，并对部分果实进行了转录组测序。在此基础上，我们比较了拟南芥、可可树和乳油木中脂类合成代谢途径及其关键酶基因。之后，我们运用系统发育分析等方法对乳油木的23个脂类合成关键酶基因进行了分析，并在酿酒酵母中进行了表征，鉴定了2个乳油木中的脂类合成关键酶；这些基因可能在未来代可可脂合成中发挥关键作用。.我们在系统分析酿酒酵母和植物脂类合成代谢途径及可可脂合成研究进展的基础上，结合课题组已有研究基础，我们应用系统发育、蛋白质相似性网络分析等方法，从公用数据库中挖掘可能的高产可可脂的关键基因。我们应用合成生物学方法对酿酒酵母菌株进行改造，并在不同脂肪酸合成菌株中表达了部分可可脂合成关键酶基因，获得了数十个不同的酿酒酵母菌株。通过脂质组学等方法比较了部分菌株的脂类合成能力，分析了不同脂类合成关键基因对工程酵母合成代可可脂产量的影响。.我们在项目执行过程中总结、发展了多组学、生物信息学、合成生物学等相结合的关键酶基因挖掘策略，建立了优化的关键酶挖掘方法。我们应用优化的关键酶挖掘方法获得了多个植物活性天然产物合成关键酶基因和其他功能酶基因，为酵母合成植物活性天然产物和其他物质奠定了一定的基础，为拓展酵母细胞工厂的应用提供了技术支持。我们在研究中还阐述了二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）等关键酶基因在酵母合成可可脂中的作用，为未来应用酵母合成代可可脂提供一定的理论基础。