利用木糖发酵产乙醇的酵母菌种研究

纤维素水解液中木糖的含量仅次于葡萄糖，促进木糖向乙醇转化是降低纤维素乙醇的重要环节。酿酒酵母是工业上生产乙醇的优良菌株，但不能发酵木糖产生酒精。异源表达细菌木糖异构酶使其具有代谢木糖产生酒精的能力，由于木糖异构酶的温度不适应性和催化效率不高及而易受副产物抑制等，酵母菌在发酵过程中存在糖醇转化效率不高；野生酵母菌还存在不耐受水解液抑制因子的问题。从非理性和理性两个方面着手对木糖异构酶进行分子改造，重点解决温度和底物的广谱适应性，研究其适应机理，使其符合人工环境变化的需要；采用驯化、比较基因组学、比较蛋白组学、基因改造等方法改造酿酒酵母，选育、构建出能利用蔗渣酶解液为碳源快速发酵生产乙醇的酿酒酵母菌株。

为解决酿酒酵母菌不能利用木糖发酵产乙醇的问题，获得能够利用木糖快速发酵产乙醇的酵母工程菌。通过基因重组技术在酿酒酵母菌中异源表达细菌木糖异构酶使其具有代谢木糖产生酒精的能力。克隆来自梭菌C. phytofermentans的木糖异构酶xylA，利用穿梭质粒p426H7构建的重组载体转化酿酒酵母Y09，以木糖为唯一碳源筛选得到重组酿酒酵母Y09-xyl。由于木糖异构酶的作用温度高和催化效率低等问题，本项目运用随机突变和定点突变技术对木糖异构酶进行分子改造，经过几轮的随机突变，成功地获得了底物亲和力提高0.9倍、酶活力提高1.8倍的突变酶。利用计算机软件计算pKa值和B-Factor值选定酶的改造位点，基于增加该酶结构的柔性，结合亚基界面氨基酸残基芳香环间的相互作用，来改善CpXI低温低pH条件下活力的策略。选取187F、K341和V162三个位点进行定向进化累积突变，筛选得到了低温条件下的活性较野生酶提高了2.5倍突变酶。.为提高酿酒酵母转化可发酵性糖产生乙醇的能力，采用代谢工程、基因工程等方法改造酿酒酵母，选育、构建优良酿酒酵母菌株Y49。 利用同源基因重组的研究策略，将能利用木糖产乙醇的毕赤酵母菌株K9与高抗性菌株MF1001的基因进行融合，获得遗传性状稳定的、高抗性的酿酒酵母基因工程菌株MK-1。.将编码木糖异构酶和木糖异构酶突变酶基因克隆至酵母菌整合载体YPKR，构建酿酒酵母整合型质粒，重组质粒包含木糖异构酶基因和G418 抗性基因表达盒，将其转化优良酿酒酵母菌Y49和MK-1，通过酵母菌染色体整合的方式将两个表达盒插入酿酒酵母的rDNA 片段，通过G418抗性和木糖为唯一碳源的筛选平板，筛选获得能够利用木糖的酿酒酵母菌Y49-xyl和MK-xyl。.对获得的重组菌株酿酒酵母菌Y49-xyl的研究显示，该重组菌株能很好的利用木糖生长，并同时发酵木糖和葡萄糖产生乙醇。当木糖和葡萄糖以质量比1：1混合发酵时，木糖和葡萄糖利用率分别为90．8％和97．3％，并且木糖醇产量很少，厌氧发酵得到了一定的乙醇产量。.蔗渣纤维素水解糖液的乙醇发酵实验表明，发酵40h的乙醇浓度达到了7.20%（V/V），残留还原糖浓度为0.98%，发酵效率为理论值的91.84%，显示所构建的酿酒酵母菌株能够发酵蔗渣纤维素水解液中的葡萄糖和木糖为碳源快速发酵生产乙醇。