骨髓干细胞动员与移植稳定修复易损斑块的实验研究

急性冠脉综合征防治的重点是易损或破裂斑块的稳定与修复。目前所采用的各种治疗方法，如药物、溶栓、介入治疗等虽能改善患者的症状和预后，但也只能起到亡羊补牢的作用。稳定易损斑块、修复破裂斑块才是未来急性冠脉综合征防治的新方向。然而，由于目前国内外缺乏研究易损或破裂斑块的理想动物模型，从而使急性冠脉综合征易损或破裂斑块的机制和干预措施的研究举步维艰。.本研究拟在前期研究成果――自创的兔动脉粥样硬化易损或破裂斑块模型基础上，利用骨髓干细胞具有分化成易损或破裂斑块修复所必需的血管内皮细胞、平滑肌细胞和胶原纤维细胞等多种细胞的潜能及独特的"归巢"功能，通过骨髓干细胞动员与移植实验，从组织水平、蛋白水平及基因水平观察骨髓干细胞稳定与修复易损或破裂斑块的可行性，追踪干细胞"归巢"至易损或破裂斑块及其分化状况，并探索干细胞超早期移植的可能性，为临床防治急性冠脉综合征等急性心脑血管事件提供理论和实验依据。

1、通过全骨髓贴壁筛选法成功获取原代MSCs，并对其进行传代及扩增；第３代的细胞经流式细胞仪分析表明培养的细胞为MSCs；并成功诱导其成骨及成脂分化。.2、成功利用不同的方案诱导MSCs向内皮细胞方向分化，并鉴定分化而来的内皮细胞具有分泌NO的功能并可表达内皮细胞表面标志物CD31。结论：诱导MSCs分化为ECs的过程中，aFGF与bFGF功能相同，其生物活性略低，但相对稳定，而bFGF易受细胞代谢活动的影响。.3、成功将携带绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒转染MSCs，转染率达80%以上，但是转染慢病毒后，MSCs的活力降低，增殖速度降低。考虑慢病毒转染后的MSCs不适合应用于大量静脉移植。.4、体外研究成功发现MSCs可减少ox-LDL所致hUVECs凋亡，其机制包括：降低炎性因子含量；改善内皮细胞增殖修复；并调节凋亡相关基因的表达。.5、成功建立动脉粥样硬化易损斑块动物模型：基于本课题组前期研究成果，并对其进行改良，成功建立易损或破裂斑块动物模型，且提高造模成功率、缩短造模时间，降低饲养成本。.6、成功验证MSCs静脉移植可以通过多种作用稳定易损斑块：HE染色及Masson染色从形态学证实MSCs移植可增加斑块稳定性；Elisa证实MSCs移植后可降低不同时间点机体血清炎性因子的表达，增加抑炎因子的表达；免疫组化证实MSCs可降低易损斑块局部NF-kB、MMP-2的表达增加斑块稳定性；rt-PCR证实MSCs移植后易损斑块局部TSG6 mRNA含量增高，从而在局部发挥抗炎作用，进而稳定易损斑块。.7、在该阶段实验中发现：MSCs移植在稳定斑块及易损斑块中可增加VEGF的表达，VEGF可协同HIF-1α促进As 斑块内血管生成，从而增加新生血管密度，增加斑块的不稳定性，有可能增加心脑血管不良事件的发生。.8、成功建立人诱导性多潜能干细胞并对其进行鉴定：以逆转录病毒作为基因转移载体，将Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因介导入脐带间充质细胞（UMC）内，将其诱导为多潜能干细胞，简称为iPS细胞。检测细胞内、外源基因的表达量，分析细胞核型，细胞免疫荧光和碱性磷酸酶染色，体内、体外分化实验，证实获取的两株iPS细胞类似于胚胎干细胞具有多向分化潜能。