假单胞菌新种NP-1抗真菌物质鉴定及生物合成分子机制研究

Bacterium strain NP-1, isolated from Eucalyptus could control Cylindrocladium leaf blight effectively. In the previous study, we found that NP-1 is a novel Pseudomonas species, and only growing on PDA plate, produces a wide-spectrum antifungal substances (AFS). Moreover, the physical and chemical properties of AFS such as strong polarity, pH 3.1, and loss-reducing antifungal activity because of pH change differ from previously-reported AFS produced by known Pseudomonas species. Additional analysis of NP-1’s secondary metabolite synthesis gene clusters showed that NP-1 produce novel antimicrobial substances, and the biosynthetic mechanism is novel presumably. At present, NP-1 antifungal substances have not been identified, and the biosynthesis mechanism is not clear, which seriously restricts the development and application of NP-1 as a biological control resource. We proposed to (1) to identify the chemical structure of the AFS produced by NP-1 using mass spectrometry, nuclear magnetic resonance and spectroscopic techniques; (2) based on the AFS structure, to screen the candidate synthetase gene and related transcript regular of AFS production using transcriptomic analysis; (3) to clone the candidate genes, construct candidate gene deletion mutants and complementary mutant strains to determine the role of candidate genes for AFS biosynthesis in NP-1, clarify the molecular biosynthetic mechanism. Completion of the project is theoretically significant for enrichment of the knowledge about Pseudomonas antimicrobial substances. And, it will lay foundation for constructing NP-1 engineered strain, and studying biological control of forestry diseases with NP-1.

申请人前期从桉树中分离到一株细菌NP-1能有效防治桉树焦枯病，具有良好的应用前景，并发现：NP-1为假单胞菌属新种，而且仅在PDA培养基上产生抗真菌物质。依据NP-1次级代谢合成基因簇分析及抗真菌物质表现出的强极性、pH 3.1、抗菌活性对pH敏感等特性，推断NP-1产生新的抗真菌物质且产生机制新颖。目前，NP-1抗真菌物质未鉴定，生物合成机制不明确，严重制约了NP-1作为生物防治资源的开发应用。本项目采用质谱和波谱技术鉴定抗真菌物质化学结构；基于化学结构，结合转录组测序与生物信息学分析，确定抗真菌物质合成酶候选基因及相应的转录调控基因；通过敲除、互补等技术验证候选基因功能，解析NP-1抗真菌物质的生物合成分子机制。项目的完成将拓展对假单胞菌抗菌物质的认识，具有重要的科学价值；同时为NP-1工程菌的构建和应用NP-1防治森林病害奠定理论基础。

假单胞菌NP-1是从邓恩桉分离出来的内生细菌，该菌株对桉树焦枯病菌等多个植物病原菌有较强的抑制作用，前期研究发现NP-1的分类地位和抗菌物质皆有新颖性。项目通过形态学、生理生化特征、多基因串联进化树，基因组鉴定等技术手段，确定NP-1为假单胞菌属新种，命名为Pseudomonas eucalyptcola，典型菌株保存在中国典型培养物保藏中心（CCTCC） M2018494。完成了NP-1全基因组完成图的构建，该菌株基因组有一个环状核基因组（CP056030）和一个环状质粒（CP056031），对基因组内次级代谢合成基因簇进行预测，共发现5条次级代谢产物合成基因簇，其中与已报道基因簇相似性最高的为bananamide合成基因簇，相似性为87%。根据NP-1在PDA培养时能够产生抗菌物质，但是在PDB中培养不产生抗菌物质的特性，对NP-1产生抗菌物质的过程和PDB培养54h进行转录组测序分析。GO以及KEGG富集结果表明NP-1在产生抗菌物质时（PDA培养54 h）运输活动、辅因子结合和ABC转运和硫代谢显著富集。Bananamide环脂肽合成基因簇的核心基因表达趋势与时间动态吻合，推断NP-1产生类bananamide类次物质Ban-Like发挥杀菌功能。使用基因敲除载体pK18mobSacB，对NP-1中环脂肽Ban-Like的核心合成酶基因ban1进行敲除，基因缺失突变体NP-1Δban1生长正常，但丧失抗菌能力。基因gacA的基因缺失突变体正常生长，但丧失抗菌能力。证明NP-1抗菌能力来源于产类bananamide类物质，并且该物质的合成受GacS/GacA调控。其中两种均注释为阻遏蛋白rsmE的基因rsmE1与rsmE2在NP-1中具有不同的功能，缺失rsmE1基因不会影响NP-1抗菌能力，而rsmE2基因缺失会使NP-1丧失抗菌能。研究发现NP-1产生的Ban-like物质可能是几个化合物的混合物，还需要进一步分析鉴定。项目的完成明确了NP-1是一个假单胞菌新种，而且产生bananamide类物质发挥抗菌作用。Bnanamide类物质是新发现的一类环脂肽物质，具有良好的应用前景。项目的完成拓展了对假单胞菌抗菌物质的认识，同时为NP-1生物农药的开发奠定了基础。