EpCAM裂解产物调控猪干细胞多能性的分子机制

The elucidation of the molecular mechanisms underlying the establishment and maintenance of pluripotency in pigs will facilitate the establishment of porcine pluripotent stem cells and obtain germline chimeric pigs. Our previous studies showed that there are similarities and differences lie in genes and signaling pathways that support pluripotency maintenance in porcine pluripotent stem cell compared to human and mice. Among them, the expression level of EpCAM reflects the degree of porcine somatic cells reprogramming. EpCAM cleavage product EpICD can promote the activation of pluripotent genes such as OCT4. However, in the early stage of porcine embryo development, the biological characteristics of EpCAM expression, cleavage is unknown. The relationship between these biological processes and the establishment of naïve pluripotency in porcine embryos is unclear. The molecular mechanisms and signaling pathways of EpCAM cleavage products (EpEX and EpICD) that target downstream genes are also unclear. This project intends to study the scientific issues such as spatio-temporal expression and cleavage patterns of EpCAM in the early embryonic development of pigs. And further analyze the role of EpEX and extracellular signal molecules on downstream target genes. Discover the transcriptional regulatory signals of EpICD, its required molecular basis and regulatory mechanisms. Further clarification of the pluripotent regulatory network, and provide new theoretical basis for the establishment of porcine pluripotent stem cells with a germline chimerism capacity.

阐明猪多能干细胞建立和维持的分子机制，有助于建立猪原始态多能干细胞，获得生殖系嵌合猪。我们的前期研究发现，猪原始态多能性维持所依赖的基因和信号通路与人和小鼠的相比，即有相似之处又存在明显差异。其中，EpCAM基因的表达水平能反映猪体细胞重编程程度，其裂解产物EpICD可促进OCT4等多能基因的激活。但在猪早期胚胎发育阶段，EpCAM的表达、裂解等生物学特性，及其与胚胎中原始态多能干细胞之间的关系尚不清楚。EpCAM裂解产物(EpEX和EpICD)对下游基因靶向调控的分子机制和信号通路也不明确。本项目拟对EpCAM在猪早期胚胎发育中的时空表达、裂解模式等科学问题开展研究。并进一步解析EpEX与细胞外信号分子对下游靶向基因的作用关系；发掘EpICD的转录调控信号及其所需分子基础和调控机制。对猪多能性调控网络进行进一步阐释，为建立具有生殖系嵌合能力的猪多能干细胞提供新的理论依据。

猪作为一种被广泛养殖的家畜，因其生理结构和器官大小与人的极其相似，因此对再生医学和农业领域研究有重要作用。而猪多能干细胞的建立可为器官移植、猪育种工作和品种保护工作提供重要的试验研究材料。本项目在执行期间主要围绕猪多能干细胞的建立、猪胚胎发育调控和猪多能性调控等方面展开研究，主要研究内容包括EpCAM基因与体细胞重编程关系、猪血小板裂解液(porcine platelet lysate, PPL)制备方法与应用、和细胞重编程机制研究。在研究过程中，我们构建了EpCAM-EGFP-D2表达载体和对应对照载体EF1A-EGFP-D2表达载体，并在不同细胞和胚胎中验证了表达载体的激活能力。在猪核移植胚胎和孤雌激活胚胎中，我们检测了不同发育阶段m6A水平，并对比了不同类型的猪胚胎m6A水平变化的差异，揭示了m6A对猪胚胎发育的调控作用。实验过程中我们建立了猪血小板裂解物的制备流程，收集新鲜猪抗凝血液后，经过系列的低速离心和分层过滤后，制备了一批可用于细胞培养的猪血小板裂解物和去除纤维蛋白原的猪血浆，通过对猪成纤维细胞和间充质干细胞的培养观察和转录组测序研究，证明了分离制备所获得的的猪血小板裂解物可有效支持不同类型猪细胞的生长，细胞周期相关和细胞增殖相关的细胞因子或受体表达水平有显著的提高，且能够支持间充质干细胞的干性维持。同时，我们还与南京农业大学红林课题组合作开展猪诱导多能干细胞的建系工作，成功建立了3株猪诱导多能干细胞系。 .在项目执行期间，共发表论文7篇，其中SCI收录7篇，申请国家发明专利3项，实用新型专利1项，其中实用新型专利已授权。培养硕士研究生6名，协助培养博士研究生2名。