利用诱导多能干细胞技术建立猪的多能干细胞系

利用动物胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）可生产克隆动物及转基因动物。对保留珍贵物种、较高效率地制造有特殊医药营养和生物学用途的高质量,高存活率的转基因动物在目前有着不可替代的作用。对于历史上难以建立ESC的物种，如猪，羊，牛等，iPS（induced pluripotent stem cell）技术无疑提供了一种替代方案。利用iPS技术生成的动物iPS细胞不仅具有ESC形态、可无限增殖、具三胚层发育潜能，而且可获得生殖系嵌合的动物。iPS技术已在小鼠，人，猕猴，大鼠几个物种上相继尝试成功。本项目拟利用基于可诱导慢病毒系统的iPS技术诱导生成猪的iPS细胞。猪iPS细胞不仅能够为评估猪ESC的特征提供标准，并且可诱导的慢病毒载体系统还有助于揭示猪ESC维持全能性的机理。猪iPS细胞还可替代难以获得的猪ESC，用于生产基因定点修饰的转基因猪。

本课题计划利用基于可诱导及非可诱导慢病毒系统的iPS技术诱导生成猪的iPS细胞。按照课题计划，我们以可诱导慢病毒系统（Tet－on系统）为载体，分别以Oct4, Sox2, c-Myc和Klf4转录因子组合及Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc，Nanog和Lin28组合进行病毒包装，将病毒的“Cocktail”共转染猪成纤维细胞及骨髓间充质干细胞，建立了猪的iPS细胞。实验结果表明：我们建立的猪iPS细胞具有类似于胚胎干细胞的特性：猪iPS克隆为碱性磷酸酶阳性；这些iPS克隆也都特异表达干细胞表面抗原SSEA-3，SSEA-4，Tra-1-60，Tra-1-81，REX1和CDH1；进一步的基因表达分析显示在猪iPS形成过程中，内源的Oct4，Nanog等关键转录因子被重新激活；获得的猪iPS细胞具有很高的端粒酶活性，并具有正常的核型；为验证这些猪iPS细胞的多能性，我们将得到的猪iPS细胞进行体外分化实验，结果显示其能够形成含所有三胚层组织的拟胚体；体内分化实验也表明，得到的猪iPS细胞注射免疫缺陷小鼠可以得到包含三胚层组织细胞的畸胎瘤。该成果发表于《Journal of Molecular Cell Biology》。猪iPS细胞不仅能够为评估猪ESC的特征提供标准；并且可诱导的慢病毒载体系统还有助于揭示猪ES细胞维持全能性的机理，筛选猪ES细胞培养体系；猪iPS细胞还可替代难以获得的猪ES细胞，用于生产基因定点修饰的转基因猪。此外，在本课题资助下，利用iPS技术我们还分别建立了绵羊及山羊的iPS细胞系，成果分别发表在《Cell Research》杂志；我们在《Stem Cell Review and Reports》上还发表了一篇人类胚胎干细胞定向分化相关的科研论文。综上，在本课题资助下，我们利用可诱导病毒表达系统介导转录因子的表达，建立了具有多能干细胞特性的猪iPS细胞系，成果已总结成文并发表在《Journal of Molecular Cell Biology》杂志，累计发表SCI论文3篇。