转录因子Otx2调控猪干细胞多能状态和启动胚层分化的分子机制

The pluripotent stem cells (PSCs) have two pluripotency states; one is naïve state that cells retain the potantial to form chimeric animals with germline transmission, and the other one is primed state that cells do not have the potantial to form chimeric animals. Currently, to establish porcine naïve PSC line remains to be difficult, however, to establish a primed state of porcine PSC line is relatively easier. To answer the scientific questions of maintaining porcine stem cell pluripotent states and exiting the pluripotency to promote the lineage differentiation will be conducive to the creation of porcine naïve PSCs and clinical applications. Our previous studies showed that porcine transcription factors Nanog and Esrrb interact with differentiation regulators Otx2 and Mettl3 with dose-dependent manner. In this project, our goals are (A) to investigate the regulation network of cell state-specific regulator Otx2 and to reavel the function of Otx2 to interact with cell state-specific enhancers and leading transcription factors to binding to enhancers, then to promote the downstream gene ivation; (B) to comfirm Otx2 as the negative genetic switch to regulate the naïve state of porcine PSCs and flip pluripotent stem cells to the lineage differentiation. This study will facilitate to optimize the culture conditions for creating porcine naïve PSCs.

多能干细胞主要存在两种多能状态，一种为原始态，细胞能够实现生殖系嵌合；另一种为激发态，细胞很难形成动物嵌合体。目前建立猪原始态多能干细胞系仍然存在困难，但是获得猪激发态多能干细胞则相对容易。弄清调控猪干细胞多能状态和启动胚层分化的分子机制这一科学问题，有助于猪原始态多能干细胞的建系及其临床应用。我们前期研究发现，猪源多能转录调控因子Nanog和Esrrb等与影响胚层分化的Otx2等因子存在剂量效应的互作关系。本项目拟在分子水平解析细胞状态特异调控因子Otx2的分子调控网络，研究Otx2对细胞状态特异性增强子的作用，及其引导转录因子与增强子结合，对下游基因转录调控的作用机制；拟在细胞水平确定Otx2作为负调控开关在猪干细胞原始态多能性维持和启动干细胞胚层分化过程中的关键调控作用，优化培养猪多能干细胞的培养体系和建系条件。

本项目的核心议题是对转录因子OTX2在猪多能干细胞多能性维持和胚层分化过程中的调控作用进行深入研究。首先（于2016年度）,我们对原始态多能性调控因子（如Nanog、Esrrb、Sox2、Sall4 等）和激发态多能性调控因子（如Otx2 和Mettl3 以及Pitx2、EpCam 等）进行了系统的分子生物学功能分析；构建了相关表达载体、启动子调控载体、RNA 干扰载体。随后（于2017年度）,对猪iPS细胞的转录组和小RNA组进行了分析，揭示了miRNAs对猪干细胞多能性状态的调控作用；深入研究了原始态多能性调控因子Esrrb和激发态多能性调控因子Otx2和EpCam 等的分子生物学特性及其对猪多能干细胞的多能性调控作用。之后（于2018和2019年度）,建立了DOX调控的猪iPS细胞系，并利用该细胞系进行iPS培养体系的筛选，建立了3i培养体系并用于猪iPS细胞的培养。我们还揭示了转录因子SALL4对OTX2基因的负调控作用，证明SALL4因子在细胞重编程中的重要功能；建立了甲醇法制备饲养层细胞的技术，其显著促进了多能干细胞的培养效率；证明小RNA miR-1343通过抑制OTX2表达发挥调控猪多能干细胞多能性的作用。上述研究结果为理清猪多能干细胞培养条件和分子调控网络奠定了良好的基础，为后续工作开辟了研究道路。