猪核移植胚胎干细胞的分离培养及多能性鉴定

目前猪胚胎干细胞（ES细胞）的培养技术还不成熟，其多能性研究也很有限，这严重制约了遗传修饰的转基因猪制备的效率。为此，本研究利用实验室已有的体细胞克隆技术平台生产的猪克隆囊胚分离内细胞团（ICM），进行ES细胞的分离培养。比较不同日龄的囊胚（7-8 d和10-11 d）对获得ES细胞克隆点效率的影响，找到克隆胚胎适合分离的日龄；对分离得到的克隆点进行传代和培养，探索猪ES细胞的适宜培养条件。通过免疫组化和多能性基因的mRNA表达等多种标记对ES细胞进行鉴定。猪ES细胞在农业和医学方面具有广阔的应用前景。利用ES细胞进行基因打靶可大大提高转基因的效率，创造出抗病力强、高产优质的家畜品种；猪是人类疾病的良好动物模型，也是异种器官移植的理想材料，ES细胞研究将加速转基因猪在人类医学上的应用。

以体细胞核移植技术获得的囊胚为材料分离猪胚胎干细胞, 采用全胚接种的方法将去透明带囊胚接种于饲养层上。猪胚胎干细胞（pES）培养体系还不成熟，优化培养体系获得更多的原代集落将为成功分离pES奠定基础。比较培养液中血清（FBS）和血清替代物（SR）含量组合对pES分离的影响，发现5%FBS和5%SR的组合(集落形成率9.5%）更有利于原代克隆的形成和pES分离。比较不同胚龄的5d、6d、7d囊胚对pES分离的影响，7d囊胚集落形成率（12.7%）高于5d、6d囊胚（5.4%，5.6%），更适合于pES分离。比较不同细胞因子mLIF、hLIF、bFGF对克隆形成的影响, 分离209枚囊胚添加hLIF和bFGF的培养液得到猪胚胎干细胞样细胞克隆2个。单一因子培养液并没发现克隆形成，因此添加hLIF和bFGF的培养液更适宜pES克隆形成。用以上优化的培养体系分离217枚核移植囊胚获得pES克隆2个，分离效率0.9%。pES克隆形成效率极低，最多传至3代，传代后克隆不增殖，多能性鉴定工作不能顺利开展。OCT4-GFP示踪体系能帮助解决多能性鉴定的问题。利用TALEN介导同源重组，将带有2A肽序列的EGFP定点插入Oct4基因终止密码子处，获得了OCT4-GFP成纤维细胞，该细胞制备的克隆囊胚在分离pES过程中可借助OCT4-GFP荧光标记来确定分离得到的pES克隆是否表达多能性基因Oct4，有利于pES多能性鉴定和培养体系的优化。全胚接种分离30枚7d孤雌囊胚得到猪滋养层干细胞（pTS）样克隆1个，分离效率为3.3%。分离得到扁平样克隆经RNA水平鉴定，表达Cdx2基因，Cdx2基因是滋养层干细胞特异性基因，因此分离得到了pTS克隆。