红细胞代谢物对大鼠心肌细胞收缩功能的影响及其机制研究

In recent years, a large number of clinical studies have shown that red blood cell transfusion longer shelf life can significantly increase the incidence of infection, renal failure, acute lung injury and other clinical outcomes vicious, but the reason is unclear. Proposed erythrocytes during storage metabolites (such as potassium ions, lactic acid, etc.) accumulated to "toxicity" a certain concentration of body cells is one of the important causes of these clinical malignant outcome. Preliminary findings confirm that more than two weeks to save time erythrocyte metabolites can seriously affect myocardial cell contraction.This study was to use Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS for further research to save the changes of erythrocyte metabolites, looking for myocardial material basis of cell contraction possible; Application of primary cardiac cell culture technology and real-time label-free dynamic cell analysis technology (Real Time Cellular Analysis, RTCA) study and preservation of the red blood cell metabolites may be material toxic effects on myocardial cells; live cell imaging techniques and applications Molecular biology techniques from the material basis of myocardial cell motility and signaling pathway level research erythrocyte metabolites beating myocardial cells on possible mechanisms for clinical patients when red blood cell transfusion to avoid the toxic effects of metabolites induced malignant outcomes and the development of new formulations of erythrocyte preservation solution provide experimental evidence.

近年大量临床研究表明输注保存期较长的红细胞可以显著增加感染、肾衰竭、急性肺损伤等临床恶性结局的发生率，但其原因尚不清楚。提出红细胞贮存过程中代谢物（如钾离子、乳酸等）积累到一定浓度对机体组织细胞的“毒性作用”是发生上述临床恶性结局的重要原因之一。前期研究结果证实保存2周以上时间红细胞代谢物可严重影响大鼠心肌细胞的收缩功能。本实验拟在此基础上应用核磁共振和基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪技术进一步研究保存期红细胞代谢物变化特点，寻找影响心肌细胞收缩的可能物质基础；应用原代心肌细胞培养技术和实时无标记动态细胞分析技术研究保存期红细胞代谢物及可能物质对心肌细胞的毒性作用；应用活细胞成像技术和分子生物学技术从心肌细胞运动物质基础和信号通路层面研究红细胞代谢物对心肌细胞搏动影响的可能机制，为临床患者输血时能避免红细胞代谢物毒性作用所致恶性结局和研制新型红细胞保存液配方提供实验依据。

临床输注的红细胞在体外保存过程中经历了一系列形态、功能和代谢的改变，期间红细胞代谢物不断堆积，这些代谢物对于组织细胞的毒性作用并不明确。本研究在体外通过悬浮红细胞上清（SSRBCs）与心肌细胞共培养来进行红细胞代谢物对心肌细胞的毒性作用评价，并对可能的毒性作用机制进行研究，以期为进一步提高输血安全提供研究依据。.研究内容：（1）将库存0d、14d和35dSSRBCs与具有搏动特性的人多潜能干细胞定向分化得到的心肌细胞（hiPS-CMs）体外共培养，通过心肌细胞搏动状态分析不同保存期红细胞代谢物的毒性作用。（2）取保存0d、14d、35d的SSRBCs，测定生化指标的水平改变、进行蛋白质组学分析。（3）配置与0d、14d、35d SSRBCs中相应浓度的钾（K）、乳酸（LA）及二者混合的溶液，分别与hiPS-CMs细胞体外共培养，评价SSRBCs中K及LA对心肌细胞的毒性作用；观察hiPS-CMs细胞形态结构及mRNA的表达变化。.结果：（1）0d SSRBCs对hiPS-CMs细胞搏动状态作用不明显; 14d SSRBCs可使hiPS-CMs细胞停止搏动，48h时搏动状态可以恢复；35d SSRBCs可使hiPS-CMs细胞停止搏动，48h时搏动状态仍未恢复。（2）保存过程中SSRBCs的K和LA水平变化最为明显；SSRBCs蛋白质组学分析显示保存35天时66蛋白水平升高，3蛋白水平降低。（3）模拟的0d、14d钾溶液和0d、14d、35d LA溶液均对hiPS-CMs细胞搏动状态无明显影响；35d钾溶液使hiPS-CMs细胞停止搏动，第48h时能够恢复；35d SSRBCs处理hiPS-CMs细胞筛选出15个与心肌细胞搏动相关的差异表达基因，可能在毒性作用中起到重要作用。.研究表明在模拟大量输血条件下，保存期长悬浮红细胞代谢物对心肌细胞具有毒性作用，保存期越长毒性作用越明显；钾在保存期长悬浮红细胞上清对心肌细胞的毒性作用中发挥了重要作用，但不是全部作用，钾离子之外的红细胞代谢物成分单独或协同发挥了心肌细胞毒性作用；心肌细胞中与心肌细胞搏动相关的部分基因可能与毒性作用机制相关，但其具体机制尚需进一步研究。提示保存时间长的红细胞大量输注可能是产生不良临床预后的危险因素，临床应用时应加以关注。