不同保存期单采血小板微粒释放规律及其对HepG2肝癌细胞增殖影响和机制研究

The research showed that platelet transfusion increased its metastasis and recurrence rate with cancer patients; A significant correlation between the level of platelet microparticles in patients with tumor invasion and prognosis. Relatively few reported about the rule of platelet particles released and the effects of tumor cell growth. Our preliminary results confirmed that the platelet microparticles released gradually increased with the prolongation of storage time, and apheresis platelets supernatant and parts of fresh frozen plasma used in clinical can promote the proliferation of HepG2 hepatoma cells. Our further study focus on the regularity of platelet microparticles number and properties in different period by flow cytometry, microspheres capture, micRNA identification, protein chip and matrix assisted laser desorption time of flight mass spectrometry techniques; Study on the effect of different platelet microparticles on proliferation of HepG2 cells by real time label free dynamic cell analysis; Study on the possible mechanism of the signal pathway of platelet microparticles level on cancer cells by bioinformatics analysis and molecular biology techniques. It will be clear that the rule of platelet microparticles’ release in the process of platelet storage, the effect on the HepG2 and its mechanism. and provide experimental basis for reducing the risk of platelet transfusion for cancer patients.

临床研究表明输注血小板会增加肿瘤患者肿瘤转移及复发风险，肿瘤患者体内血小板微粒水平与肿瘤侵袭性和临床预后显著相关，但血小板在保存过程中血小板微粒释放规律及其对肿瘤细胞生长影响的研究鲜见报道。我们前期研究结果证实，单采血小板随保存时间延长其微粒释放逐渐增多，且单采血小板上清和部分临床用新鲜冰冻血浆对HepG2肝癌细胞增殖具有促进作用。本项目拟在此基础上应用流式细胞、微球捕获、蛋白芯片和基质辅助激光解析飞行时间质谱等技术，研究单采血小板在不同保存期血小板微粒数量和微粒性质的释放规律；应用实时无标记动态细胞分析技术研究不同数量及性质的血小板微粒对HepG2细胞增殖能力的影响；应用生物信息学分析技术预测血小板微粒发挥促进HepG2细胞增殖的信号通路，用分子生物学研究其作用机制。明确单采血小板在保存过程中血小板微粒释放规律和对HepG2细胞的作用及其机制，为降低肿瘤患者血小板输注风险提供实验依据。

背景: 研究不同保存期血小板微粒和外泌体释放的量和大小变化规律。研究单采血小板保存过程中代谢物质的变化，保存血小板上清及血小板外泌体，血小板微粒对肿瘤细胞的作用并探讨可能机制。.研究内容：健康献血员10人份混合样本，分别分装存放0d，3d，5d，7d，取50ml梯度离心法提取血小板微粒和外泌体，同时留取血小板上清和乏外泌体上清。ELISA法检测PMPs的浓度变化，流式细胞技术检测微粒大小的变化，用透射电镜和western-blot技术鉴定外泌体。液相质谱分析技术检测外泌体蛋白的变化和功能预测；Transwell试验检测PMPs肝癌细胞迁移和浸润的影响；流式细胞技术检测细胞凋亡；转录测序分析单采血小板微粒作用前后的基因变化；荧光定量PCR技术验证PMPs对肿瘤细胞作用前后目的基因及其相对量。.重要结果：1、单采血小板保存0d、3d、5d和7d时血小板微粒浓度增加。用三个大小分别为0.22μm、0.45μm和1.35μm大小的磁珠定标，流式细胞检测发现血小板微粒的大小随着保存时间的延长呈现增大趋势。不同保存天数血小板外泌体miRNA相比具有明显给的统计学差异（P<0.01）。.2、单采血小板外泌体不同浓度和不同作用时间对肿瘤细胞系K652、HepG2和HCT116的增殖作用没有统计学意义（P>0.05）。单采血小板保存上清和乏血小板上清对肿瘤细胞K652、HepG2和HCT116有抑制增殖作用（P<0.01）。.3、PMPs能促进肝癌细胞HepG2 和Huh7浸润和迁移，但是PMPs对肝癌细胞HepG2和Huh7的凋亡作用没有统计学意义（P>0.05）；转录测序和基因定量分析发现基因FOSL1、BCL2L11、CDKN2D和RAB5B是PMPs对肝癌细胞HepG2和Huh7作用的可能调控基因。.科学意义：单采血小板保存过程中血小板微粒和外泌体释放增多，微粒的大小呈现增大趋势；单采血小板外泌体对肿瘤细胞的无增殖作用，而保存血小板上清则能抑制肿瘤细胞的增殖。PMPs促进肝癌细胞的浸润和转移，改变肿瘤细胞的炎性环境，基因FOSL1、BCL2L11、CDKN2D和RAB5B是其可能的调控基因。