利用基因敲除技术结合蛋白质组学分析裂殖壶菌产DHA的氮源调控分子机制

Because they contain abundant bioactive substances such as proteins and unsaturated fatty acids beneficial to human health, marine organisms become the excellent source of human healthy foods. The study on marine organisms has gained people's increasing attention.As one of polyunsaturated fatty acids from marine organisms, DHA (docosahexaenoic acid) has been widely used in the production of functional foods and medical research. Meanwhile, the molecular regulation mechanism of DHA synthesis in Schizochytrium sp. is not clear so far, which seriously restricts the industrial production of DHA. To solve this problem, this project first intends to construct the recombinant Schizochytrium sp. of conditional knockout glnA gene (structural gene of glutamine synthetase) through Cre-LoxP recombination system on the basis of the previously proposed mechanism of nitrogen source assimilation and PII regulation. Through proteomic analysis, the project will continue to study the differential expression levels of proteins induced by addition of glutamic acid (Glu) during DHA synthesis period in recombinant Schizochytrium sp.of conditional knockout glnA gene, and to find their tendency of variation. Then, it further analyzes the regulatory system of PII so as to determine the molecular mechanism of DNA synthesis regulated by Glu. Thereby it will be hoped to establish the network model of DNA synthesis responding to Glu as one nitrogen signal. Results of this project will have important theoretical meaning and extensive applicable value in improving the level of DHA production and even the oil production of marine microorganism in our country.

海洋生物由于含有丰富的有益于人类健康的蛋白质和不饱和脂肪酸等活性物质，成为人类健康食品极好的来源，其研究正日益受到人们的关注。DHA（二十二碳六烯酸）作为一种来源于海洋生物的高度不饱和脂肪酸，在功能食品和医药研究方面具有广泛的应用前景。本研究针对目前海洋裂殖壶菌合成DHA的分子调控机制不清晰，严重制约其工业化生产这一关键问题，在既往提出的氮源利用与PII调控机制的基础上，拟利用Cre-LoxP重组系统构建谷氨酰胺合成酶基因glnA条件性敲除的裂殖壶菌突变体。在此基础上，利用蛋白组学技术分析比较在DHA合成期加入谷氨酸信号分子对glnA基因敲除前后细胞内蛋白组表达的影响，并进一步对PII调控体系进行分析，从而确定谷氨酸调控DHA合成的分子调控机制，进而建立氮源信号调控DHA合成的应答网络模型。本项目的研究结果对提高我国DHA的研究乃至海洋微生物产油的研究具有重要的理论意义和应用价值。

二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）具有促进婴幼儿脑部发育、保护视力和预防、治疗心血管疾病等多种重要的生理功能，常作为功能性因子添加到保健食品和功能食品中而受到了广泛关注。由于它的广泛用途，其全球市场需求量也大大增加。利用裂殖壶菌发酵生产DHA已成为当前研究的热点，但DHA产量普遍较低。本项目针对目前海洋裂殖壶菌合成DHA产量低及分子调控机制不清晰，严重制约其工业化生产这一关键问题，主要研究了三大部分内容。（1）项目组筛选获得一株高产DHA的新菌株，GC分析该菌株DHA在总油脂中的含量高达56.24%，是获取天然高浓度DHA的良好资源，利用其发酵生产DHA极具开发前景，鉴定并命名为裂殖壶菌LU310.然后，项目组对该菌株进行了高密度培养研究，项目组获得的碳氮源补加策略（在葡萄糖浓度低于1 g/L时，间歇补加葡萄糖使之维持15 g/L同时在72 h时补加0.4 g/L的谷氨酸钠）即有利于细胞的生长又能促进DHA的积累。摇瓶培养最终获得的生物量、DHA产量和DHA产率分别为88.6 g/L，24.74 g/L和241.5 mg/L/h，该结果优于大多数文献报道的摇瓶结果。5 L发酵罐碳氮源流加培养使生物量128.7 g/L、总油脂64.21 g/L和DHA产量32.05 g/L，其中总油脂含量60.88%，基本实现了高密度培养裂殖壶菌发酵生产DHA。（2）项目组探索了适合产油微生物可溶性蛋白质组样品的制备方法，研究选用了三种产PUFAs微生物，即裂殖壶菌（产DHA），高山被孢霉（产ARA），和小克银汉霉（产GLA）作为研究对象，建立了从产油微生物中快速并有效地去除油脂并提取蛋白的方法——冷激法，这为蛋白分析研究者提供很好的蛋白分离工具，从而促进产油微生物在蛋白质组学方面的研究。运用冷激法对裂殖壶菌LU310蛋白组学分析，初步分析鉴定出与油脂积累相关的重要蛋白，为以后在分子水平上揭示产油微生物的油脂积累机制奠定了基础。（3）项目组运用合成生物学技术构建了裂殖壶菌的遗传转化体系，将乙酰辅酶A合成酶基因（ACS）、TEF1启动子、CYC1终止子、NPTⅡ抗性基因和裂殖壶菌18S rRNA基因依次克隆到载体pBluscript SKⅡ上，形成新的重组表达体系。试图将裂殖壶菌合成DHA的关键酶基因进行重组表达，以期能从根本上提高裂殖壶菌的DHA产量。