基于脂质组学的裂殖壶菌脂质反耗分子机制的研究

Under certain conditions, such as nutrient starvation, meiosis and sporation stages, lipid turnover typically commences in oleaginous microorganisms, which lead to hydrolysis of non-polar oils providing energy and intermediate metabolites for cell metabolism. During lipid turnover stage of Schizochytrium, the intracellular saturated fatty acids were preferentially hydrolyzed and the long-chain polyunsaturated fatty acids were concentrated rapidly. Therefore, it is very important to elucidate the molecular mechanisms of lipid turnover for improving the quality and increasing the yield of DHA of Schizochytrium. The primary aims of this project are to elucidate the molecular mechanisms of lipid turnover, improve and perfect the regulation mechanisms of lipid metabolism, enhance the yield and quality of DHA of Schizochytrium by means of genetic engineering methods, as well as improve the environmentally friendly processes of Schizochytrium fermentation. Accordingly, the migration of intracellular fatty acids during the lipid turnover stage of Schizochytrium will be explored using lipidomics methods. Moreover, the transcriptions of the key enzyme genes and the activities of enzymes, including lipases, glycerol kinase and TAG synthase etc., will be analyzed.

在一定营养条件下，特别是饥饿、减数分裂和孢子形成阶段，产油微生物通过脂质反耗促使胞内的非极性油脂发生水解，为细胞代谢提供所需的能量和中间产物。裂殖壶菌脂质反耗导致其胞内饱和脂肪酸被优先水解，长链多不饱和脂肪酸得以迅速“浓缩”。阐明裂殖壶菌脂质反耗的分子机制，对改善裂殖壶菌DHA品质，提高DHA产率具有重要的意义。本项目拟利用脂质组学研究方法对裂殖壶菌脂质反耗过程中胞内脂肪酸的迁移规律进行系统研究，分析脂肪酶、TAG合成酶和甘油激酶等脂质反耗关键酶基因转录水平和酶活的变化规律，阐释裂殖壶菌脂质反耗的分子机制，为进一步完善裂殖壶菌脂质代谢调控机制，通过基因工程手段提高裂殖壶菌DHA产率，优化DHA品质，改善裂殖壶菌工业发酵生产DHA的环境友好性提供理论依据和新思路。

裂殖壶菌是一种重要的产油微生物，因其单细胞油脂中富含二十二碳六烯酸（DHA，22:6 n-3）而受到广泛关注。本课题以裂殖壶菌为对象，运用基于液质联用的磷脂分析方法，从磷脂组学的角度，对裂殖壶菌在不同碳源发酵条件的磷脂代谢进行了系统研究。.首先，考察了裂殖壶菌分别在葡萄糖和甘油两种碳源条件下的发酵特性。结果表明，以葡萄糖作为碳源时，菌体生长速度较快；而以甘油作为碳源时，总脂和DHA的含量较高。在甘油和葡萄糖发酵后期，菌体都发生了脂质返耗现象，尤以甘油发酵的脂质返耗速率较快。其中，棕榈酸含量由反耗前的41.18%降低至反耗后的21.33%，DHA则由31.20%上升至50.43%。脂肪酸合成酶（FAS）产物下降幅度为28.23%，而聚酮合成酶（PKS）产物上升幅度达29.45%。甘油三酯变化规律表明发酵前期14:0-14:0-16:0、14:0-16:0-16:0和16:0-16:0-16:0会优先积累，其在发酵后期的优先水解促进了16:0-22:6-22:6、16:0-22:6-22:5、22:6-22:6-22:6和22:6-22:6-22:5的富集。通过UPLC-Q-TOF-MS对裂殖壶菌磷脂组成进行定性分析，共鉴定出五类91种磷脂分子。在葡萄糖和甘油作为碳源时， PI分子和PC分子含量基本呈上升趋势。利用甘油发酵时，PC分子的含量在发酵中期有所下降；PA分子和PG分子含量先上升在下降；PE分子含量较低，在发酵过程中含量变化不太明显，整体上呈下降趋势。最后结果表明，磷脂脂肪酸的迁移主要集中于在饱和脂肪酸及长链多不饱和脂肪酸，而甘油三酯脂肪酸的迁移主要为C14:0和C16:0。RT-qPCR分析结果表明，IPLA，IPLB和IPLD基因参与调控磷脂的代谢。ITGL1，ITGL2及ITGL3参与甘油三酯的水解。并且ITGL1是发酵后期的主要脂肪酶，ITGL2及ITGL3起辅助作用。本课题研究结果揭示了裂殖壶菌脂质返耗阶段脂肪酸的迁移规律，并在基因转录水平阐释了脂肪酸迁移的分子机制，为后续工程化改造裂殖壶菌，定向合成特殊DHA脂质提供了理论指导。