基于转录组学和代谢物组学的裂殖壶菌脂肪酸FAS与PKS合成途径的调控机制研究

Schizochytrium is well known as an important docosahexaenoic acid (DHA) producer with two kinds of fatty acid synthesis pathways, i. e., fatty acid synthase pathway (FAS) and polyketide synthase pathway (PKS). DHA and docosapentaenoic acid (DPA) are mainly synthesized via PKS pathway, and other fatty acids are synthesized by FAS pathway. However, how the synthesis of fatty acids is regulated keeps unclear. Thus, this study will focus on the regulation mechanism of fatty acid synthesis via PKS and FAS pathways for higher DHA yield. Different stress (low temperature, high C/N ratio, low dissolved oxygen, etc) will be used to promote the production of DHA. Mass spectrometry (MS), nuclear magnetic resonance (NMR), and metabolic flux analysis (MFA) will be used to analyze the intracellular metabolites (especially for acetyl coenzyme A, NADPH and ATP) and fatty acids at metabolomics level under different conditions. Based on the results, enzymes [e.g., citrate lyase (ACL), acetyl-CoA carboxylase (ACC), malic enzyme (ME), fatty acids synthase (FAS) and polyketide synthase (PKS)] catalyzing key reactions will be analyzed at transcriptomics level, and the change of their activity will also be analyzed. With the obtained knowledge in this study, a global response model of metabolites will be finally established to reveal the regulation mechanism of the FAS and PKS pathways, which will support the enhancement of DHA production in Schizochytrium via metabolic engineering.

裂殖壶菌是重要的二十二碳六烯酸（DHA）生产菌株，其体内存在着两种脂肪酸合成途径（脂肪酸合酶途径（FAS）与聚酮合酶途径（PKS）），其中PKS途径主要用于合成长链多不饱和脂肪酸， 如二十二碳六烯酸（DHA）、二十二碳五烯酸（DPA），而其它类型的脂肪酸则由FAS途径合成。阐明裂殖壶菌的PKS及FAS脂肪酸合成途径的调控机制对提高其DHA产率具有重要意义。本项目利用转录组学和代谢物组学分析方法，研究裂殖壶菌在正常及促进DHA积累的胁迫条件（如低温、高碳氮比、低溶氧）下关键基因的转录水平及胞内代谢物及代谢流的变化情况，结合关键酶的活力分析，从底物、辅因子供给、及关键基因的转录表达及酶表观活力等角度，探索裂殖壶菌胞内碳流在FAS及PKS途径间分配的规律，结合裂殖壶菌的全基因组代谢重建模型，尝试解析裂殖壶菌脂肪酸FAS与PKS合成途径的调控机制，为提高裂殖壶菌的DHA产率提供理论指导。

裂殖壶菌是重要的二十二碳六烯酸（DHA）生产菌株，其体内存在着两种脂肪酸合成途径（脂肪酸合酶途径（FAS）与聚酮合酶途径（PKS）），其中PKS途径主要用于合成长链多不饱和脂肪酸，如二十二碳六烯酸（DHA）、二十二碳五烯酸（DPA），而其它类型的脂肪酸则由FAS途径合成。阐明裂殖壶菌的PKS及FAS脂肪酸合成途径的调控机制对提高其DHA产率具有重要意义。本项目利用多组学手段如转录组学、蛋白组学和代谢物组学分析方法，研究了裂殖壶菌在正常及促进DHA积累的胁迫条件下关键基因的转录水平及胞内代谢物及代谢流的变化情况，从底物、辅因子供给、及关键基因的转录表达及酶表观活力等角度，阐述了裂殖壶菌胞内碳流在FAS及PKS途径间分配的规律。首先利用转录组和蛋白组技术对正常和低温条件下裂殖壶菌的生长及油脂和DHA积累进行分析，发现在油脂积累期FAS与PKS基因均显著下调，说明脂肪酸的供给不是油脂积累的限速步骤，同时在脂肪酸组成上饱和脂肪酸（SFA）含量显著下降（23.3%），多不饱和脂肪酸（PUFA）含量显著上升（22.1%），还发现主要为油脂合成提供还原力NADPH的酶苹果酸酶（ME）和葡萄糖6磷酸脱氢酶（G6PDH）及6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（PGD）在低温条件下的转录水平有了明显差异，处于磷酸戊糖代谢途径（PPP）中的G6PDH与PGD的表达明显强于ME的活性，在随后的代谢流分析过程也证实了碳源流经PPP途径的强度与裂殖壶菌胞内多不饱和脂肪酸积累量的相关性在99%以上，可以推测裂殖壶菌胞内DHA合成所需要的NADPH主要由G6PDH供给的，而SFA合成所需要的NADPH主要由ME供给。与此结果提出了基于不同来源还原力NADPH供给的裂殖壶菌油脂合成调控假说，并基于此假说设计了针对还原力供给的发酵底物添加策略，在细胞生长中期添加4 g/L的苹果酸使油脂产量增加了12.5%。此外，分别在裂殖壶菌细胞内过表达了内源的ME和G6PDH，实验结果证明，过表达ME可以使饱和脂肪酸含量提高10.1%，而过表达G6PDH可以使DHA含量提高8.3%。通过本项目，解析了裂殖壶菌还原力供给对脂肪酸合成的调控机制，为提高裂殖壶菌DHA的产率提供理论指导。