钙调素在低温促进裂殖壶菌DHA积累中的作用机制研究

Schizochytrium sp is one of the most promising DHA production strain, low temperature has a significantly effect on DHA accumulation. In previous study, we demonstrated knock-out sspCaM1, sspCAMTA1and sspCBF1 gene decreased DHA accumulation at low temperature; However, how the three protein play the role in DHA accumulation still need to be elucidated. In this work, we will employ Co-IP, ChIP-seq,EMSA, mutant construction and reporter assay to investigate: ① protein interaction domain of SspCAMTA1 and SspCaM1; ② the DNA binding site of sspCBF1 promoter and SspCAMTA1 ;③ target DNA sequences and genes which SspCBF1 bind and regulate. These results will demonstrate our hypothesis that low temperature promote DHA accumulation though up-regulated SspCaM1 activating SspCAMTA1 and finally up-regulated SspCBF1.The illustrated mechanism will provide possible approaches for the genetic manipulation on Schizochytrium for DHA high-production.

裂殖壶菌是一种重要DHA生产菌种，低温能促进其DHA的积累，但其作用机制尚未知晓。前期我们证实敲除钙调素SspCaM1基因，钙调素结合转录激活子SspCAMTA1基因，冷刺激转录因子SspCBF1基因中任何一个均会降低低温DHA的积累，但SspCaM1，SspCAMTA1，SspCBF1如何促进（单独或者联合）低温DHA积累的机制尚未详细阐述。本研究拟通过Co-IP，构建突变体，ChIP，EMSA等实验，验证SspCaM1与SspCAMTA1存在相互作用及SspCAMTA1与sspcbf1启动子结合；明确SspCaM1与SspCAMTA1及SspCAMTA1与sspcbf1启动子的结合区域及关键位点；探索SspCBF1的调控基因集。阐明低温通过上调SspCaM1激活SspCAMTA1，进而调控SspCBF1促进裂殖壶菌DHA积累的分子机制。该机制的阐明将为裂殖壶菌良种选育奠定基础。

低温能够显著提高裂壶藻不饱和脂肪酸DHA的含量，阐明其机制将有利于裂壶藻的良种选育。在前面的研究中，我们发现SspCaM1，SspCAMTA1及SspCBF1可能在低温促进裂壶藻DHA的合成起重要作用。本研究利用理化实验和组学分析，对低温促进裂壶藻DHA合成的可能机制进行了研究。研究结果表明：① SspCaM1能够与SspCAMTA1存在相互作用，但是SspCaM1/SspCAMTA1复合蛋白不能与SspCBF1的启动子区域结合；② Fatty acid synthase途径（FAS途径）和polyketide synthase 途径（PKS途径）分别负责裂壶藻中饱和脂肪酸（C15:0,C16:0,C17:0,C24:0）和不饱和脂肪酸（DPA,DHA）的合成。FAS途径中长链脂肪酸脱氢酶的整体缺失是FAS途径不能合成DHA的主要原因；③ 低温促进DHA的累积，不是通过直接上调PKS途径基因，而是通过上调分支氨基酸和磷酸戊糖途径代谢基因（增加脂肪酸合成底物乙酸辅酶A和NADPH的供给，进入PKS途径以提高不饱和脂肪酸DHA的合成）和下调FAS途径及malic enzyme基因的表达（减少脂肪酸合成底物乙酸辅酶A和NADPH进入FAS途径合成饱和脂肪酸）来实现。此外，基于所获得的数据，对裂壶藻的基因组特征及进化地位进行了分析。分析结果表明，裂壶藻在漫长的进化过程中，基因逐步纯和，与吞噬相关的基因家族出现明显的扩张。进化树分析表明，裂壶藻属于原生生物，在进化上与褐藻和硅藻处于不同的分支，进化分支中只有褐藻和硅藻能够进行光合作用，表明褐藻和硅藻在漫长的进化过程中获得了进行光合作用的能力。这些研究结果为裂壶藻的脂肪酸合成途径提供了组学和理化水平的证据，提出了一种低温促进裂壶藻DHA积累的可能机制，为裂壶藻不是菌，不是藻，而是原生生物提供了从基因组水平的证据。