五倍子活性成分抗金黄色葡萄球菌的作用靶点及分子机理研究

Staphylococcus aureus, can cause many kinds of infections in humans and animals, is one of the most common pathogens among humans and animals. However, there are only a limited variety of drugs to choose against S. sureus in veterinary clinic due to drug resistance and other reasons. In our previous studies, we found that Galla Chinensis has good antibacterial effect on S.aureus and other pathogenic bacteria. On the basis of previous studies, the active components of Galla Chinensis against S.aureus were isolated and analyzed. In vivo experiments will be performed with mouse sepsis model for protection test and treatment test. The effects of the active components of Galla Chinensis on the bacteria structure and biofilm of S. aureus were determined by the detection content of AKP, β-galactosidase and scanning electron microscopy technology. In order to explore the target proteins and target signal pathway of gallnut active components, iTRAQ technology will be used to find differentially expressed proteins after drug treatment, and qRT-PCR technology will be used to verify differentially expressed genes, to preliminarily elucidate the mechanism of action of gallnut active components on S. aureus. This project not only provides the basis for the screening of antibacterial targets, but also has significant sense and practical value to prevention and control infection of S. aureus.

金黄色葡萄球菌是一类广泛分布的人兽共患病原菌，可以引起人和动物的多种感染，但由于耐药性等原因在兽医临床可供选择的抗金葡菌的药物种类有限。申请人在前期研究中发现五倍子对金黄色葡萄球菌等多种病原菌具有良好的抑菌作用。本研究拟在前期研究的基础上，对五倍子抗金黄色葡萄球菌的活性成分进行分离和成分分析，明确五倍子的主要抑菌成分；以小鼠败血症模型研究其体内抗金黄色葡萄球菌的作用。通过测定AKP、β-半乳糖苷酶的含量以及扫描电镜等方法明确五倍子活性成分对金黄色葡萄球菌结构和生物膜的影响。采用iTRAQ技术寻找药物处理后的差异表达蛋白，qRT-PCR技术进行差异基因的验证，探索五倍子活性成分抑制金黄色葡萄球菌的靶蛋白及靶信号通路，初步阐明五倍子有效成分对金黄色葡萄球菌的作用机理。本研究不仅为抗菌作用靶点的筛选奠定基础，而且对金黄色葡萄球菌感染的防控具有实用价值。

从天然药物中开发抗菌药物是药物研发的有效策略。本研究对五倍子不同活性成分的含量进行了测定，并对其体外抗金黄色葡萄球菌作用进行了比较，筛选出单宁酸作为五倍子的有效活性成分，进行了体内外抗金黄色葡萄球菌的作用研究，并进一步对其抗菌机制进行了研究。结果显示，单宁酸在体外对金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC6538的MIC为32µg/mL。通过测定金黄色葡萄球菌感染小鼠的致死量和最大耐受量，分别建立小鼠败血症模型和非致死模型，开展了单宁酸和五倍子提取物对败血症模型的治疗作用，结果显示单宁酸可显著降低人工感染金葡菌败血症模型小鼠的死亡率，实验结束时五倍子提取物组和单宁酸组小鼠存活率与对照组相比分别提高了20%和30%。单宁酸可降低人工感染金葡菌非致死小鼠模型的脏器载菌量，显著改善小鼠肺部的出血和炎性细胞浸润。对单宁酸抑制金黄色葡萄球菌的作用机理研究表明，单宁酸可使菌体细胞膜皱缩，使其通透性增加，使蛋白含量显著减少。单宁酸对金黄色葡萄球菌的生物被膜形成和成熟生物被膜均有抑制作用。通过联合蛋白组学和转录组学分析单宁酸抑制金黄色葡萄球菌的分子机制发现，单宁酸可抑制金葡菌细胞壁合成，主要包括肽聚糖和磷壁酸的合成酶，从而影响细胞通透性；单宁酸通过抑制氨基酸生物合成和代谢，抑制核糖体50S亚基从而影响蛋白质的生物合成。本项目研究了五倍子活性成分单宁酸对金葡菌的体内外抑制作用，并阐明了其可能的作用机制，为进一步开展单宁酸的抑菌机理奠定了研究基础，同时也为开发抗金黄色葡萄球菌的药物提供了理论依据。