KRT9蛋白异源二聚体配对蛋白鉴定和表皮松解性掌跖角化病致病机制研究

Hereditary palmoplantar keratoderma (PPK) is a group of genodermatoses characterized by hyperkeratotic palms and soles, which are of high clinical and genetic heterogeneity. The disease-causing genes of epidermolytic palmoplantar keratoderma (EPPK) have been identified as the KRT9 gene and the KRT1 gene, however, the hereterodimer partner of KRT9 protein remains unclear, and little is known about its key pathogenic molecules and signaling pathways. We have identified the novel KRT9 gene c.1369C>T missense mutation in an EPPK pedigree, and in vitro studies supported that this mutation may cause keratin network damage by dominant negative effect. KRT9 mutant protein may cause imbalanced keratinocyte proliferation and apoptosis via regulating apoptotic inhibitors and pro-apoptotic factors, resulting in epidermal hyperplasia and hyperkeratosis. In this study, we plan to identify more hereditary PPK disease-causing gene mutations and the hereterodimer partner of KRT9 protein. By taking advantage of the novel KRT9 gene mutation cell model and EPPK patient tissue samples, we will analyze the molecular genetic mechanism and related signaling pathways underlying the KRT9 gene mutation, and evaluate the efficacy and target specificity of shRNA virus vector silencing the mutated KRT9 gene, hoping to provide new theoretical basis for clinical gene-targeted therapy of EPPK.

遗传性掌跖角化病是一类以掌趾表皮异常过度角化为特征的遗传性皮肤病，具有高度临床和遗传异质性。表皮松解性掌跖角化病的致病基因为KRT9和KRT1基因，但KRT9蛋白的异源二聚体配对蛋白尚未明确，对该病关键致病分子和信号通路知之甚少。我们在一个表皮松解性掌跖角化病家系中鉴定出新的KRT9基因c.1369C>T错义突变，体外实验支持该突变可能通过显性负性效应损害角蛋白网。KRT9突变蛋白可能通过调节凋亡抑制子和促凋亡因子，引起角细胞增殖与凋亡失衡，最终产生表皮增生和过度角化。本研究拟鉴定更多遗传性掌跖角化病致病基因突变和KRT9蛋白异源二聚体配对蛋白。利用新KRT9基因突变细胞模型和表皮松解性掌跖角化病患者组织标本，解析KRT9基因突变的分子遗传学机制和相关信号通路，评估shRNA病毒载体沉默突变型KRT9基因的有效性和靶向特异性，为该病临床基因靶向治疗提供新理论依据。

遗传性掌跖角化病是一类以掌趾表皮异常过度角化为特征的遗传性皮肤病，具有高度临床和遗传异质性。表皮松解性掌跖角化病的致病基因主要为KRT9，但KRT9蛋白的异源二聚体配对蛋白尚未明确，对该病关键致病分子和信号通路知之甚少。前期研究中，我们在一个表皮松解性掌跖角化病家系中鉴定出新的KRT9基因c.1369C>T错义突变，体外实验支持该突变可能通过显性负性效应损害角蛋白网。在本次研究中，我们通过联合免疫共沉淀和质谱技术鉴定了KRT9互作蛋白，并运用反向免疫共沉淀、免疫荧光和定量共定位分析证实KRT6C是KRT9的异源二聚体配对蛋白。SWISS-MODEL和PyMOL软件构建的三维模型显示KRT6C和KRT9的2B结构域能够互相结合并形成典型的螺旋结构域。Metascape进行蛋白质组学分析显示KRT6C和KRT9角蛋白对参与一个紧密连接的蛋白质相互作用网络，而这些蛋白质共同参与调节角蛋白骨架组成和功能以及角化过程。我们提出，在未来进一步探索角蛋白的生理功能和相关皮肤病的发病机制过程中，可以更多地关注这些特定的紧密相关的蛋白网，将其视为一个整体，它们的功能改变可能共同作用于皮肤病的发病机制。由于KRT6的三种亚型KRT6A、KRT6B、KRT6C具有高度同源性，目前的抗体制备技术不足以区分哪个亚型才是KRT9的配对蛋白。本研究显示，免疫共沉淀联合质谱技术作为一项高灵敏性技术，它的使用能够弥补抗体技术的不足，能帮助区分这三种亚型，并鉴定出KRT9的异源二聚体配对蛋白为KRT6C。在对KRT6C和KRT9角蛋白对关系新认识的基础上，我们首次提出，应该将遗传性皮肤病EPPK和PC-K6c（一种轻型的先天性厚甲症，KRT6C致病）在分子水平上重新分类，将它们看作一组遗传性缺陷病。KRT9/KRT6C配对角蛋白关系的发现，也将为理解参与EPPK和PC-K6c发病的角蛋白网络奠定基础。